核酶抗體酶的學習教案

核酶抗體酶的學習教案第1頁/共46頁核酶（Ribozyme)一、概述二、剪接型核酶三、剪切型核酶四、核酶的應用五、核酶技術面臨的問題六、脫氧核酶（deoxyribozyme)第2頁/共46頁1、對酶及生物催化劑的認識的發(fā)展一、概述生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質類：天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第3頁/共46頁2、長期以來，人們認為只有某些蛋白質才有生物催化功能。但近些年研究發(fā)現，某些RNA分子也具有生物催化功能，被稱為Ribozyme。1982年Cech等發(fā)現四膜蟲細胞大核期間26SrRNA前體具有自我剪接功能，并于1986年證明其內含子L-19IVS具有多種催化功能。1984年Altman等發(fā)現RNaseP的核酸組分M1RNA具有該酶的活性，而該酶的蛋白質部分C5蛋白并無酶活性。Cech和Altman因發(fā)現Ribozyme而獲得1989年度諾貝爾化學獎。第4頁/共46頁3、核酶作用的特點化學本質RNA底物RNA肽鍵ā-葡聚糖分支酶反應特異性(專一性）堿基催化效率低產物第5頁/共46頁剪切型核酶剪接型核酶根據催化反應錘頭核酶I內含子II內含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP4.核酶的分類第6頁/共46頁二、剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪有接的方式除去內含子（Intron).剪接型核酶分類1、I類內含子2、II類內含子第7頁/共46頁1.I類內含子的自我剪接(Self-splicing)剪接機制L-19IVS在體外的多種酶活性核酶是一種金屬依賴酶結構與功能的關系引導序列：IVS中的6個嘌呤核苷酸序列5‘CUCUCU3’3’GGGAGG5’G結合位點:IVS中的P7莖區(qū)空間結構第8頁/共46頁核酶是一種金屬依賴酶金屬離子的作用：1、特異的結構作用，或參與活性部位的化學過程2、促進RNA的總體折疊3、二價金屬離子（如Mg2+）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復合物的形成第9頁/共46頁2、Ⅱ類內含子的自我剪接剪接機制結構與功能的關系第10頁/共46頁三、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA1、1剪切機制1、2結構與功能的關系

錘頭結構

(Hammerhead)

發(fā)夾結構(Hairpin)

斧頭結構(Axehead)

假結樣結構(Pseudoknot-like)1、3影響核酶活性的因素第11頁/共46頁2、異體催化剪切型RNA

核糖核酸酶P(RNaseP)是內切核酸酶，是核糖核蛋白體復合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白質亞基組成。體外：M1RNA具催化作用蛋白質作為輔助因子體內：M1RNA和蛋白質對酶活性都是必需的。2、1剪切機制

Mg2+2、2結構與功能的關系M1RNA5‘端完整結構對維持催化活性是必需的。胰腺癌護理胰腺癌康復胰腺癌飲食：第12頁/共46頁RNaseP可剪切前體5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關，表明在RNaseP的組分內沒有引導序列，RNaseP所識別的是底物的高級結構。RNaseP底物的二級結構剪切位點第13頁/共46頁第14頁/共46頁1、轉核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內切酶作用

CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN第15頁/共46頁核酶在醫(yī)學上的應用1、核酶抗肝炎病毒的研究目前人們已進行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工設計核酶多為錘頭狀結構，少部分是采用發(fā)夾狀核酶。2、抗人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶1998年，美國加利福尼亞大學Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶抑制HIV-Ⅰ基因表達，并率先進入臨床Ⅰ期。3、抗腫瘤治療核酶能在特定位點準確有效地識別和切割腫瘤細胞的mRNA,抑制腫瘤基因的表達，達到治療腫瘤的目的。第16頁/共46頁

五、核酶技術面臨的問題1、核酶催化切割反應的可逆性問題2、提高催化效率3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導入靶細胞4、使核酶在細胞內有調控地高效表達5、增強核酶在細胞內的穩(wěn)定性6、對宿主的損傷問題有待進一步考察第17頁/共46頁六、脫氧核酶的研究1、體外選擇技術篩選脫氧核酶分子脫氧核酶分子的體外選擇是通過優(yōu)先擴增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子來實現的。通過這一技術已有兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來。8-17，10-23。2、脫氧核酶催化特征10-23裂解位點為嘌呤、嘧啶連接雙鏈穩(wěn)定性越高，酶活性越高結合臂的長度影響酶催化轉換性RNA-DNA比RNA-RNA穩(wěn)定性差。對Mg2+,Zn2+,Ca2+,Mn2+有依賴性組氨酸，精氨酸促進催化活性極強的切割特異性（單堿基錯配即可大幅降低切割活性）第18頁/共46頁10-23型脫氧核酶作用機理RYRRNAsubstrate切割點R=AorGY=CorUdeoxyribozyme53第19頁/共46頁手槍型脫氧核酶自我剪切作用機理莖II(催化部位)莖I(結合部位)5‘3‘3‘CA切割點10203040第20頁/共46頁p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內含子的剪接機制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘第21頁/共46頁p2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內含子的剪接機制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接第22頁/共46頁BAA5‘BBABAPCRPCR5‘5‘5‘StreptavidinColumnNaOHcofactor體外選擇技術篩選具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子庫）第23頁/共46頁

Ⅰ類內含子二級結構通式保守序列G結合位點剪接部位引導序列第24頁/共46頁Ⅱ類內含子有一個保守的二級結構：結構域Ⅰ：兩個保守內含子結構序列EBS1,EBS2與兩個外顯子結構序列IBS1,IBS2互相配對。結構域Ⅴ：高度保守，催化活性必需。結構域Ⅵ：A提供2‘-OHⅡ類內含子二級結構模式5’3’第25頁/共46頁5個環(huán)和4個螺旋形成兩個結構域剪切反應發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端兩個內部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)Ⅱ的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的。5‘3‘發(fā)夾二級結構模型剪切位點第26頁/共46頁HDVRNA斧頭結構模式

三個堿基對的莖需要二價陽離子，產生5‘-OH和2’,3’-環(huán)磷酸剪切部位剪切部位第27頁/共46頁

這類RNA進行自身催化的反應是只切不接。特點：在Mg2+

或其他二價金屬離子存在下，在特定的位點，自我剪切，產生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯末端。

剪切機制核酶自身剪切反應第28頁/共46頁

mRNA剪接過程

mRNA剪接反應是在剪接體（splicesome)上進行的.5種snRNA剪接體50多蛋白質第29頁/共46頁錘頭結構的五種類型R示酶，S示底物，箭頭示剪切位點第30頁/共46頁建議的L19RNA催化機理第31頁/共46頁錘頭型核酶對切割位點的識別位點遵守NHH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價金屬離子參與。單金屬離子催化雙金屬離子催化第32頁/共46頁第33頁/共46頁錘頭型核酶的二級結構和空間立體結構示意圖三個雙螺旋區(qū)13個核苷酸殘基保守序列剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生第34頁/共46頁UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲rRNA前體自我剪接反應第35頁/共46頁CCCUCUOP+HOG

3’OAoooCCCUCUOPOAoOGCCCUCUOH+P-oGoAoo過渡態(tài)第36頁/共46頁CCCUCUOPOAoOGoCCCUCUOPOAoOGMg2+Mg2+o過渡態(tài)金屬離子催化第37頁/共46頁第38頁/共46頁錘頭（Hammerhead)結構二級結構模型錘頭二級結構編號錘頭結構的類型錘頭核酶的催化反應機制第39頁/共46頁17位（X）的核苷酸殘基多數是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會對酶活性產生很大影響錘頭二級結構編號7位核苷酸17位核苷酸第40頁/共46頁發(fā)夾（hairpin）結構發(fā)夾核酶發(fā)現于三種不同植物RNA病毒，即煙草環(huán)點病毒，菊苣黃色斑點病毒型和筷子芥花葉病毒。三種發(fā)夾核酶分別是這些RNA病毒衛(wèi)星RNA的負鏈，英文縮寫分別是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均為單鏈RNA。

發(fā)夾核酶結構模型

發(fā)夾核酶催化機制金屬離子在催化反應中起結構作用，其剪切活性比錘頭結構核酶高。第41頁/共46頁GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGACCAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCUUCCGCCUCAGGUAAGCG3‘5‘剪切位點HDV核酶假結樣結構ⅠⅡⅢⅣL3L4J1/2