單克隆抗體與基因工程抗體制備課件

單克隆抗體與基因工程抗體制備多克隆抗體

(Polyclonalantibody)

概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的，稱為多克隆抗體。單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)概念:通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點(diǎn):針對(duì)單一表位結(jié)構(gòu)相同功能均一

雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤技術(shù)流程兩種親本細(xì)胞的選擇與制備

細(xì)胞融合

雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化兩種親本細(xì)胞的選擇與制備小鼠骨髓瘤細(xì)胞免疫脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)：穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥嘌呤）防止支原體污染（胎牛血清）融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％

用高純度高活性抗原刺激免疫小鼠免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞，此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高?？扇苄钥乖庖咴匀?，一般要加佐劑，

10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）。沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果細(xì)胞融合當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸時(shí)，細(xì)胞膜可能融合在一起。融合細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。骨髓瘤細(xì)胞

PEG

雜交瘤細(xì)胞

脾細(xì)胞

細(xì)胞融合劑：PEG作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同融合后細(xì)胞的類型:

未融合的脾細(xì)胞（壽命短，5-7天死亡）

雜交瘤細(xì)胞（分泌抗體和永生性）

未融合的瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)

氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)融合后不同細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞在HAT中生長，其中僅少數(shù)是分泌特異性McAb的細(xì)胞，而且有的培養(yǎng)孔生長多個(gè)細(xì)胞群落，必須篩選。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí)，開始檢測特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系?？煽康暮Y選方法須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)?？寺』褐笇⒖贵w陽性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽性雜交瘤細(xì)胞的凍存陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，防染色體丟失、變異及污染配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇單克隆抗體的制備經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。單克隆抗體的純化鹽析凝膠過濾離子交換層析親和層析法辛酸沉淀法用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）。單克隆抗體的性質(zhì)鑒定Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot免疫動(dòng)物培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞

收集致敏的B淋巴細(xì)胞收集骨髓瘤細(xì)胞

細(xì)胞融合

HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞檢測篩選陽性細(xì)胞

克隆化培養(yǎng)（反復(fù)3-5次）

獲得穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株

McAb的制備（雜交瘤培養(yǎng)上清或誘生腹水）

McAb純化及鑒定單克隆抗體特性優(yōu)點(diǎn)：理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備缺點(diǎn)：制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴；反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體；應(yīng)用有一定的局限性等等

單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑（1）病原微生物抗原抗體的檢測（2）腫瘤抗原的檢測（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測（4）激素測定（5）細(xì)胞因子的測定蛋白質(zhì)的提純腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)基因工程抗體與抗體庫技術(shù)單抗體內(nèi)應(yīng)用和療效受限原因：1.鼠源性單抗對(duì)人體有較強(qiáng)的免疫原性2.注入人體的單抗在腫瘤部位的攝取量甚少3.生產(chǎn)成本高,難于普及應(yīng)用人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破原因:融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫新思路：盡量減少抗體中的鼠源成分，但又盡量保留原有的抗體特異性?；蚬こ炭贵w：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體，主要包括嵌合抗體、人源化抗體、小分子抗體、抗體融合蛋白和雙特異性抗體?？贵w庫技術(shù)：用細(xì)菌克隆取代B細(xì)胞克隆表達(dá)抗體，不經(jīng)細(xì)胞融合，甚至不經(jīng)免疫，制備針對(duì)任何抗原的單克隆抗體。嵌合抗體(chimericantibody)從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性