酶促動(dòng)力學(xué)-生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：獨(dú)立性，廣泛應(yīng)用性。幾種常用生物大分子制備技術(shù)光譜技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)放射性同位素技術(shù)分子克隆、外源基因表達(dá)、分子雜交要求：實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸恚翰僮鳎航Y(jié)果：分析/討論：注意事項(xiàng)：

實(shí)驗(yàn)七酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

概念：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素。反應(yīng)速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物增加的速度，常用初速度來(lái)衡量。產(chǎn)物0時(shí)間初速度酶促反應(yīng)速度逐漸降低酶促反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)展曲線影響酶促反應(yīng)速度的因素：底物濃度[S]酶濃度[E]反應(yīng)溫度pH值抑制劑激活劑中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)

E+SESE+Pk1k2k3一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響米---曼氏方程

（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米-曼氏方程解釋：當(dāng)[S]Km時(shí)，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]當(dāng)[S]Km時(shí)，vVmax,即[S]而v不變[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K3[E]底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響V=Vmax[S]Km+[S]矩形雙曲線：Km值與Vmax值測(cè)定雙倒數(shù)作圖法又稱林-貝氏作圖法（1934）1=

Km

1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax二、酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶的最適pH:酶催化活性最高時(shí)的pH。2810pH酶的活性

pH對(duì)某些酶活性的影響A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶三、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響AB一些酶的最適pH值酶最適pH胃蛋白酶1.8過(guò)氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8四、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響五、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響抑制作用:直接或間接地影響酶的活性中心,使酶活性降低或喪失。抑制劑：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)?？赡嬉种?reversibleinhibition)

抑制劑與酶以非共價(jià)鍵疏松結(jié)合引起酶活性的降低活喪失,結(jié)合是可逆的,能夠通過(guò)透析、超濾等物理方法使酶恢復(fù)活性?？赡嬉种祁愋停焊?jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（non-competitiveinhibition）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitiveinhibition）(一)競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)

概念競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競(jìng)爭(zhēng)同一種酶的活性中心,從而影響E與S的結(jié)合。SSEEIIEE+P無(wú)I有I

競(jìng)爭(zhēng)性抑制的底物濃度曲線v競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用過(guò)程[S]競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：I與S分子結(jié)構(gòu)相似；Vmax不變，表觀Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對(duì)濃度比例。（二）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（non-competitiveinhibition）

概念

抑制劑與酶分子活性中心以外的其它部位結(jié)合而抑制酶活性，I和S與酶結(jié)合不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用過(guò)程：

SSEEEE+PSESIIII思考題：1、概念：酶、酶活性、反應(yīng)初速度、酶活性中心、必需基團(tuán)、Km、最適溫度、最適pH、競(jìng)爭(zhēng)性抑制、2、比較競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)及林-貝氏圖；簡(jiǎn)述競(jìng)爭(zhēng)性抑制的理論和實(shí)際意義。可逆性抑制作用的動(dòng)力學(xué)比較作用特點(diǎn)無(wú)抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制與I結(jié)合組分動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀Km表觀Vm雙倒數(shù)作圖斜率縱軸截距橫軸截距KmVmKm/Vm1/Vm-1/KmEKm(1+[I]/Ki)VmKm(1+[I]/Ki)/Vm1/Vm1/Km(1+[I]/Ki)E、ESKmVm/(1+[I]/Ki)Km(1+[I]/Ki)/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-1/KmESKm/(1+[I]/Ki)Vm/(1+[I]/Ki)Km/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-(1+[I]/Ki)/Km酶的分類1、氧化還原酶（oxidoreductase）2、轉(zhuǎn)移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、異構(gòu)酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或連接酶（ligase）1.加入酶液立即計(jì)時(shí)，迅速混勻置37℃水浴15min。注意：酶促反應(yīng)開始，從加入酶液起計(jì)時(shí)至下一步加入堿性溶液停止反應(yīng)，各管反應(yīng)時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)確一致，均為15分鐘。2.保溫后各管立即加入0.5MNaOH溶液1.0ml，快速混勻，防止局部濃度過(guò)高。3.各管混勻之后再分別加入0.3%4-AA1.0ml及0.5%K3Fe（CN）62.0ml，混旋儀充分振蕩混勻，使顯色完全。室溫放置10min后以6號(hào)管校正零點(diǎn)，在分光光度計(jì)中比色(λ=510nm)注意：必須立即混勻，否則顯色不完全。

注：表1～表3中，基質(zhì)液即底物液（磷酸苯二鈉）

表1表2以下操作同表1步聚中1、2、3、步

表3