第五章親和層析分離技術

第五章親和層析分離技術第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一親和層析技術5.1簡介5.2親和層析理論5.3親和層析介質活化5.4常見底親和層析技術第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一利用生物大分子之間的專一性識別性或特定的相互作用的分離技術稱為親和層析分離技術5.1簡介第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一簡介——親和配基單專一性的小分子配基基團專一性小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基因專一性的大分子親和配基第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一參數(shù)生物專一性（AC）擬生物專一性配基親和層析IMACDLACHLAC專一性很高較高中等較高，取決于吸附條件配基交聯(lián)技術很多環(huán)氧化物直接吸附或對氧化物解吸難易中等容易化學交聯(lián)容易容易吸附容量低，0.1-1.0%配基利用高高中等再生及穩(wěn)定性較差，易變性高高高，可用濃或處理成本高較低最低較低不同親和層析分離方法的比較第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一簡介——親和洗脫

親和洗脫是和親和吸附（AffinityAdsorption）對應的，即利用在洗脫液中加入和吸附目標蛋白有專一性的物質，而只將目標分子解吸下來。親和洗脫可用于親和層吸，也可以用于普通的層析如離子交換等的解吸。親和洗脫一般采用和目標分子具有識別性的小分子或類似物。第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一親和層析分離技術親和層析的理論親和介質的制備常見的親和層析第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.2親和層析的理論當?shù)鞍踪|在非凝膠相和凝膠相之間達到平衡第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一親和層析的理論對正常的凝膠過濾色譜而言親和色譜中，固定配基在蛋白和凝膠之間產生的額外親和作用第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一親和層析的理論第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一實際上，Ve’/Ve很難測定，但在洗脫液中，加入可活性配基或競爭性抑制劑，使固定配基的表邊的親和力降低，其數(shù)值可以測得親和層析的理論第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一推導得到在可溶性親和競爭性配基的存在下，固定配基對酶的阻滯作用降低，其程度取決于可溶性配基和固定配基的相對濃度和解離常數(shù)。親和層析的理論第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.3親和介質的制備介質的選擇介質的活化和偶聯(lián)親和配基固定偶聯(lián)的密度的測定間臂分子的選擇第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一介質的選擇通常而言，親和色譜的介質應具備下面四個條件：

具有多孔網絡結構非特異吸附小，基質化學性質應是惰性，表面電荷盡可能低；理化性質穩(wěn)定，不因共價偶聯(lián)反應的條件及吸附條件的變化而發(fā)生變化；基質必須能夠活化或功能化介質是親和配基附著的基礎，起著支撐和骨架作用第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一介質的選擇多糖類：

纖維素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）

瓊脂糖（agarose）

聚丙烯酰胺無機基質

可控制孔徑多孔玻璃（CPG）、

陶瓷和硅膠第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一介質的選擇用于分析時，專一性比容量及穩(wěn)定性重要，而應用制備時，吸附劑的穩(wěn)定性是最主要的指標，同時還要考慮成本因素。對于不同的介質而言，這些要求不可能同時滿足。所以在介質的選取時，應該根據具體的分離要求選擇合適的介質。專一性（Specifcity）、容量（capacity）及穩(wěn)定性（stability）是衡量所選介質好壞的三個標準第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一介質的活化和偶聯(lián)介質的活化和偶聯(lián)多糖基質

溴化氰法，三嗪法高碘酸鹽法環(huán)氧化物法苯醌法其他活化劑聚丙烯酰胺基質

戊二醛法肼法多孔玻璃與硅膠第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一溴化氰法多糖基質第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一三嗪法多糖基質第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一高碘酸鹽法多糖基質第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一環(huán)氧化物法多糖基質第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一苯醌法多糖基質第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一其他方法——甲苯磺酰氯多糖基質第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一戊二醛法聚丙烯酰胺基質第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一聚丙烯酰胺基質肼法第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一多孔玻璃與硅膠第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一親和配基固定偶聯(lián)的密度的測定分光光度法重量差法分析水解作用分析元素分析法第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一間臂分子的選擇由于生物大分子的空間結構及層析介質本身孔結構的因素，往往在配基和基質骨架之間引入一個間臂分子，可顯著地提高配基的空間利用度，即提高吸附容量。間臂分子的引入時要考慮兩個因素：空間位阻，疏水作用第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.4常見的親和層析核苷酸及輔酶和層析固定化金屬離子親和層析染料親和層析免疫親和層析基團專一性大分子親和層析共價色譜第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一常見的核苷酸及輔酶親和層析介質配基分類配基生產公司典型應用腺苷腺苷3’，5’－環(huán)化單磷酸（CAMP）PLBiochemicalSIGMA腺苷激酶及脫氨酸腺苷－3’，5’二磷酸（3’，5’－ADP）PLBiochemicalSIGMAPharmcia依賴輔酶A的酶腺苷－5’－單磷酸（AMP）PLBiochemical磷酸化酶腺苷－5’－三磷酸（AIP）PLBiochemical激酶輔酶輔酶A（CoA）PLBiochemicalCoA轉移酶，乙酸-CoA酶氧化型輔酶I（NAD＋）PLBiochemicalSIGMA5-核苷酸酶氧化型輔酶Ⅱ（NADP＋）PLBiochemical核酸酶核苷酸鳥苷-5’-三磷酸SIGMA谷氨酸脫氫酶5.4.1

核苷酸及輔酶親和層析第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose間接偶聯(lián)法示意圖核苷酸及輔酶親和層析第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一核苷酸及輔酶親和層析核苷酸親和層析的合成

碳二亞胺直接法偶聯(lián)間接偶聯(lián)法

核苷酸親和層析的吸附和解吸第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.4.2

固定化金屬離子親和層析螯和基團和金屬離子的選擇親和層析介質的合成固定化金屬離子親和層析的吸附和解吸條件第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.4.3

染料親和層析染料親和層析介質的制備蛋白質的吸附和解吸第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一染料親和層析CibacronBlueF3G-A結構圖第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一其中R為:染料親和層析ProcionRedH-E3B結構圖第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一染料配基和蛋白質作用大小排列第一組第二組第三組第四組第五組ProcionBlueMX-7RXCibacronBlue2-RAProcionYellowMX-6GRemazolOrgane3RCibacronBrown3-GRAProcionRedMX-4RProcionYellowMX-4RRemazolOrganeRCibacronBlueF3-GAProcionRedH-E3GRemazolBlueRProcionYellowH-E6RProcionBlueMXGProcionOrgangeMX-2RProcionRedMX-7BProcionblueH-ERDProcionGreenH-E4BDProcionRedH-3B染料親和層析第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.4.4免疫親和層析免疫親和層析介質的制備免疫親和層析的吸附和解吸第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一比較項目單抗多抗設備需求多簡單手工時間多少抗體數(shù)量大中等提供的持久性長期短抗體質量高低親和專一性可高可低多數(shù)專一性高免疫親和層析單抗和多抗的比較第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5.4.5

基團專一性大分子親和層析ProteinA親和層析

IgG抗體解吸：1Macetatebuffer0.1MglyceicineHClbufferConA親和層析

糖蛋白：免疫球蛋白，IgM

低密度酯蛋白肝素親和層析第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一原理（a）吸附過程；（b）洗脫過程；（c）再生過程5.4.6

共價色譜第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一引入硫醇基引入雙硫鍵

共價介質的合成第42頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一共價色譜的吸附和解吸1、上樣預處理2、吸附

吸附時間較長，柱子長度檢測3、解吸

10－25mMDTT（二硫蘇糖醇），

25－50mM