雙向電泳詳細(xì)操作過(guò)程

本文格式為Word版，下載可任意編輯——雙向電泳詳細(xì)操作過(guò)程蛋白質(zhì)的雙向電泳

一、試驗(yàn)原理：

2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分開(kāi)，其次向SDS是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分開(kāi)后的蛋白進(jìn)一步分開(kāi)。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。二、試驗(yàn)步驟：

1.芽孢桿菌蛋白質(zhì)的提取

2.蛋白質(zhì)樣品的純化

將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)冷凍枯燥，放在-80度冰箱里備用，取出蛋白質(zhì)干粉300mg加水化液(尿素水化儲(chǔ)存溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，離心，吸除丙酮酸，用超純水中（加DTT），清洗兩次，離心，加水化液溶解。水化液配置：用ddH20定容

水化液尿素（60.06）

硫脲（76.12）CHAPSDTT(154.2)

濃度7M/L2M/L4%1%

100ml42.0g15.2g4g1g

20ml8.4g3.04g0.8g0.2g

（注：DTT現(xiàn)用現(xiàn)加）

3.Bradford法測(cè)蛋白含量

取0.001gBSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量。取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序參與0ul,20ul,40ul,60ul,80ul,100ul的BSA溶解液，在分別參與100ul,80ul,60ul,40ul,20ul,0ul,分別參與4ml的Bradfor。另取2管中分別參與2ul的待測(cè)樣品溶液，各管中分別參與4ml的Bradfor，搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測(cè)定各濃度BSA的OD值，再測(cè)樣品OD值。(測(cè)量過(guò)程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成)。例如：

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：Y=aX+b.其中Y為OD值，X為蛋白含量。a、b通過(guò)作圖輸入數(shù)

據(jù)可知

G250的配置：稱取G250固體0.1g加水定容至1L。使用前濾紙過(guò)濾。

比色皿用70%的乙醇保存，待用時(shí)用雙蒸水沖洗，再用無(wú)水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再參與待測(cè)樣品溶液潤(rùn)洗，然后，參與樣品，測(cè)定OD值。

表-1五種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較

方法凱氏定氮法（Kjedahl法）雙縮脲法（Biuret法）Folin-酚試劑法（Lowry法）考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)紫外吸收法50～100μg1～5μg考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)其λmax由465nm變?yōu)?95nm蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收

各種嘌呤和嘧啶，各種核苷酸強(qiáng)堿性緩沖液，TritonX-100,SDS5μg磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，各種硫醇1～20mg靈敏度0.2～1.0mg原理將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為氮，用酸吸收后滴定多肽鍵加堿性銅離子生成紫色絡(luò)合物干擾物質(zhì)非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分開(kāi)）硫酸銨，Tris緩沖液和某些氨基酸3.雙向電泳第一向IEF（雙向電泳中一律使用超純水,16-18個(gè)小時(shí)）

3.蛋白質(zhì)的水化

蛋白質(zhì)的上樣濃度，選用膠條長(zhǎng)度17cm，PH3-10：蛋白質(zhì)上樣量為600ug/300ml,最終體積為300ml，蛋白質(zhì)含量為600ug。

若測(cè)得蛋白質(zhì)量：B為12ug/ul(600/12=50)，按每管50ul分裝，加250ul水化液體，最終體積300ul（體積300ul，蛋白質(zhì)含量600ug）。

IPG膠條蛋白質(zhì)載樣量（考馬氏亮藍(lán)R-250）

膠條長(zhǎng)度7cm11cm17cm

4.取出-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cmpH3-10），室溫中放置30分鐘。而后，用鑷子去除IPG膠條上的保護(hù)層。

5.加樣：沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性參與樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。分兩次吸取樣品，每次300ul,按從正極到負(fù)極的順序參與點(diǎn)樣槽一側(cè)(17cm，pH3—8，蛋白質(zhì)上樣量600ug/300ul)膠條。

加樣體積125ul185ul300ul樣品蛋白量169ug250ug405ug

6．將IPG膠條膠面朝下置于樣品溶液上，膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極并與電極緊湊接觸，不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡，使水化液浸濕整個(gè)膠條，10分鐘。

7.在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油(根據(jù)不同膠條長(zhǎng)度,本試驗(yàn)2ml)，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的參與礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴漸漸加在塑料支撐膜上，蓋上蓋子放置在室溫，14小時(shí)。（用水平儀調(diào)整膠曹的水平）

8．上膠：取出過(guò)夜的膠條，正面向上放置在用超純水潤(rùn)濕的濾紙上吸除礦物油。取濾紙橋用超純水潤(rùn)濕，放置在IEF的正負(fù)兩級(jí)上。從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中，同時(shí)參與礦物油，注意把氣泡趕出，蓋上蓋子。17cm聚焦盤

9.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。將聚焦槽水平放入等電聚焦儀中，設(shè)置等電聚焦程序。其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦（16-18小時(shí)）

溫度

最大電流

膠條水化體積電壓

S1(50v,slow，慢速溶脹)S2(250v,line,線性除鹽)S3(1000v,rapid,快速除鹽)S4(9000v,line,線性升壓)S5(9000v,rapid,快速聚焦)S6（500v,rapid快速保持）

選擇所放置的膠條數(shù)。

設(shè)置每根膠條的極限電流。（50?A/根）設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（20℃）

IPG運(yùn)行條件(17cm膠條)

20℃

50uAperIPGstrip300(17cmIPGstrip)時(shí)間10min30min50mine4.50h65000vh任意時(shí)間

高通量聚焦槽

10.IEF主機(jī)通電檢查，如屏幕顯示如下，則為正常

BIO-RADLABORATORIESPROTEANIEFCELLFIRMWAREVERSION1.40SYSTEMINITIALIZATION

之后，屏幕會(huì)顯示如下REHYDRATION>PRESETMETHOD>STOREDMETHOD>NEWMETHOD>

IPG膠條所需水化液體積

膠條長(zhǎng)度(cm)

每條需水化液體體積(ul)

不同膠條長(zhǎng)度膠條等電聚焦程序設(shè)置：

7cm膠條

水化12小時(shí)（18℃）主動(dòng)水化（50V）或被動(dòng)水化

S1S2S3S4S5

250V500V4000V4000V500V

線性快速線性快速快速

30分鐘30分鐘3小時(shí)

除鹽除鹽升壓聚焦保持

7125

11200

13250

18350

24450

20,000伏小時(shí)任意時(shí)間

選擇所放置的膠條數(shù)。

設(shè)置每根膠條的極限電流。（50?A/根）設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（20℃）11cm膠條

水化12小時(shí)（20℃）主動(dòng)水化（50V）或被動(dòng)水化

S1S2S3S4S5

250V1000V8000V8000V500V

線性快速線性快速快速

30分鐘除鹽除鹽升壓聚焦保持

30分鐘4小時(shí)40,000伏小時(shí)任意時(shí)間

選擇所放置的膠條數(shù)。

設(shè)置每根膠條的極限電流。（50?A/根）

設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（17℃）

17cm膠條

水化12小時(shí)（20℃）S1S2S3S4

250V1000V

主動(dòng)水化（50V）或被動(dòng)水化

30分鐘1小時(shí)

除鹽除鹽升壓聚焦保持

線性快速線性快速

10000V10000V5小時(shí)60,000伏小時(shí)任意時(shí)間

S5500V快速選擇所放置的膠條數(shù)。

設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（20℃）

4.雙向電泳其次向SDS.1配制12.5%的丙烯酰胺凝膠兩塊

設(shè)置每根膠條的極限電流。（50?A/根）

配膠：（最有膠液的總體積200ml）(10%SDS3ml稱取0.3g10%APS3ml稱取0.3g)(1).ddH2062.7ml

(2).30%Acr/Bis83.3ml（購(gòu)買）

(3).1.5mol/LTris—HClPH=8.850ml（購(gòu)買）(4).10%SDS2ml配置(5).10%APS2ml配置

(6).TEMED（購(gòu)買）35-40ul

（注：10%APS和TEMED最終在灌膠前加，參與后在攪拌時(shí)盡量減少氣泡）4.2灌膠（注意短板的擺放）

將玻璃板洗凈后，室溫晾干。然后,將電泳槽平衡好，在兩塊膠之間放夾層，最終的蓋板用鉗子擰緊，以免漏膠。將將配好的膠倒入注入玻璃板夾層中，上部留約1cm的空間超純水封面，保持膠面平整膠曹（3ml左右ddH20壓膠，注意不要有氣泡產(chǎn)生）。將做好的膠用保鮮膜蓋住，膠放置4小時(shí)。

表1配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分開(kāi)膠所用溶液

不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）

溶液成分

6%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED8%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED10%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED12%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED15%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED

52.611.30.050.050.0042.31.31.30.050.050.0031.91.71.30.050.050.0021.621.30.050.050.0021.12.51.30.050.050.002

105.322.50.10.10.0084.62.72.50.10.10.00643.32.50.10.10.0043.342.50.10.10.0042.352.50.10.10.004

157.933.80.150.150.0126.943.80.150.150.0095.953.80.150.150.0064.963.80.150.150.0063.47.53.80.150.150.006

2010.6450.20.20.0169.35.350.20.20.0127.96.750.20.20.0086.6850.20.20.0084.61050.20.20.008

2513.256.30.250.250.0211.56.76.30.250.250.0159.98.36.30.250.250.018.2106.30.250.250.015.712.56.30.250.250.01

3015.967.50.30.30.02413.987.50.30.30.01811.9107.50.30.30.0129.9127.50.30.30.0126.9157.50.30.30.012

4021.28100.40.40.03218.510.7100.40.40.02415.913.3100.40.40.01613.216100.40.40.0169.220100.40.40.016

5026.51012.50.50.50.0423.213.312.50.50.50.0319.816.712.50.50.50.0216.52012.50.50.50.0211.52512.50.50.50.02

1.1配制12.5%的丙烯酰胺凝膠：

配膠：（最有膠液的總體積200ml）(10%SDS3ml稱取0.3g10%APS3ml稱取0.3g)(1).ddH2062.7ml

(2).30%Acr/Bis83.3ml（購(gòu)買）

(3).1.5mol/LTris—HClPH=8.850ml（購(gòu)買）(4).10%SDS2ml配置(5).10%APS2ml配置

(6).TEMED（購(gòu)買）35-40ul{(5)和(6)使膠凝固｝

（注：10%APS和TEMED最終在灌膠前加，參與后在攪拌時(shí)盡量減少氣泡）

1.2電泳液配置：（4L）

甘氨酸

SDS

Tris

57.6g4g12.12g

ddH20

定容4L

2.灌膠：將玻璃板洗凈后，室溫晾干，然后，將電泳槽平衡好，玻璃板夾好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠，蓋板用鉗子擰緊，以免漏膠。將配好的膠倒入注入玻璃板夾層中，上部留約1cm的空間超純水封面，保持膠面平整膠曹（3ml左右ddH20壓膠，注意不要有氣泡產(chǎn)生），做好的膠用保鮮膜蓋住，膠放置4小時(shí)。3.平衡液配制（減少電內(nèi)滲，使被分開(kāi)的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合）

平衡液

尿素1.5mol/LTris-HCl

甘油

SDS溴酚藍(lán)ddH20

濃度6M1.5M30%2%0.002%加至10ml

100ml36.04g3.34ml30ml2g200ul100ml管分裝

50ml18.02g1.67ml15ml1g100ul50ml-20°C

4.配制膠條平衡緩沖液I。｛10ml平衡液儲(chǔ)液中加DTT0.1g。（2根膠條）｝

加DTT使變性的非烷基化蛋白處于還原狀態(tài)

5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚

濾紙用超純水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。

6.將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中參與5ml膠條平衡緩

沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢晃動(dòng)15分鐘。

膠條的長(zhǎng)度膠條平衡緩沖液I膠條平衡緩沖液II7cm2.5ml2.5ml11cm4ml4ml17cm6ml6ml18cm6ml6ml24cm8ml8ml7.配制膠條平衡緩沖液II。｛10ml平衡液儲(chǔ)液中參與碘乙酰胺0.5g。（2根膠條）｝

加碘乙酰胺使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止其在電泳過(guò)程中重新氧化

8.第一次平衡終止后，完全倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙

吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再參與膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢晃動(dòng)15分鐘。

9.用濾紙吸去SDS聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的其次

向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。

11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電