細(xì)胞培養(yǎng)及材料細(xì)胞毒性檢測

細(xì)胞培養(yǎng)及材料細(xì)胞毒性檢測第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二前言細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞管理及保藏細(xì)胞毒性檢測

主要內(nèi)容第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二WilhelmRoux(1850-1924)1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語。1.前言第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二AlexisCarrelFranceRockefellerInstituteforMedicalResearch

NewYork,NY,USAb.1873

d.19441907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。他建立的雞胚胎成纖維細(xì)胞持續(xù)了34年之久(1912-1946)第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二器官培養(yǎng)(Organculture)：將活體中整個(gè)器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長并同時(shí)保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。組織培養(yǎng)(Tissueculture)：把活體的一小片組織（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，細(xì)胞自其周圍移出并生長。細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)：把提取的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，后進(jìn)行培養(yǎng)，增殖。2.基本概念腫瘤胚胎成體粗切消化細(xì)切修切細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞便于觀察檢測條件可控均一性便于人工篩選第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞的差異失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，趨向單一性分化減弱可能獲得不死性第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型貼壁型：動(dòng)物的正常細(xì)胞懸浮型：血液淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起中有卵圓形核成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二

生長特點(diǎn)：

排列成放射狀，漩渦狀

并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)

第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程原代細(xì)胞：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞原代培養(yǎng)：將從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)傳代細(xì)胞：在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則無菌無毒、生物相容性清潔的環(huán)境品質(zhì)良好的細(xì)胞來源，培養(yǎng)基配制使用高純度藥品和去離子水有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法培養(yǎng)用的液體極多，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，配制濃度準(zhǔn)確，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二3.細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細(xì)胞生長條件：培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件：液氮罐，超低溫冰箱第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二常用儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)高壓蒸汽滅菌器過濾除菌裝置倒置顯微鏡水純化裝置恒溫培養(yǎng)箱電熱干燥箱離心機(jī)、天平、水浴、搖床液氮罐冰箱：4℃、-20℃、-80℃第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)器材移液器移液管吸管培養(yǎng)瓶：25cm2、75cm2、150cm2培養(yǎng)皿：30、60、120毫米多孔培養(yǎng)板：4、6、24、96孔離心管凍存管第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二√××第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％～95％血清5％～20％青、鏈霉素各100U／ml完全培養(yǎng)基的組成第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二天然培養(yǎng)基：

血清血漿組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）

培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基：

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）

56℃，30分鐘。血清的消毒：過濾除菌血清的使用第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二其他細(xì)胞培養(yǎng)用液水：新鮮的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度常用的緩沖液：生理鹽水

PBS

Hanks液

（D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。配制

具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬U/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬U/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬U。

使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青、鏈霉素的濃度最終為100U/ml。慶大霉素：使用終濃度為100U/ml，廣譜、穩(wěn)定。第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二主要作用：

水解與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞分離。常用濃度：0.25%

用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank’s配制，用濾器過濾除菌。消化時(shí)間：

用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用。

胰蛋白酶溶液消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、膠原酶溶液第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二物品濕熱干熱過濾紫外化學(xué)氣體消毒劑電離輻射培養(yǎng)室工作臺(tái)＋＋＋玻璃制品＋＋＋金屬器械＋＋＋＋塑料制品＋＋＋橡膠制品＋＋＋＋培養(yǎng)用液＋＋布類棉類＋＋第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二貼附生長型細(xì)胞

必須貼附于底物才能生長的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。4.細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法粘著、粘附（attachment）鋪展（spreading)第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二得到細(xì)胞1）取材→切割組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法2）直接購買→培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）傳代體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)液→清洗→加入消化液→吸棄消化液→加入培養(yǎng)液→吹打分散細(xì)胞→分裝稀釋細(xì)胞→補(bǔ)加培養(yǎng)液→繼續(xù)培養(yǎng)第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二接種數(shù)量為5×104～8×105個(gè)/ml。傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長前有較長的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。傳代注意事項(xiàng)第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二游離期

懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期

貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期

此時(shí)細(xì)胞有生長活動(dòng)，基本無增殖。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對數(shù)生長期

細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）

細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性細(xì)胞傳代的增殖生長過程第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞觀察肉眼觀察：培養(yǎng)液的顏色和透明度顯微鏡觀察生長良好的細(xì)胞：細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清生長狀態(tài)不良的細(xì)胞：細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?；胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)；細(xì)胞之間空隙增大；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落；有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞計(jì)數(shù)每毫升細(xì)胞數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞生長的指標(biāo)細(xì)胞生長曲線貼壁率有絲分裂指數(shù)(MI)：分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比細(xì)胞群體倍增時(shí)間四唑鹽(MTT)比色法標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)摻入量第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比臺(tái)盼藍(lán)法四唑鹽(MTT)比色法熒光素雙乙酸酯法(FDA)第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二四唑鹽（MTT）比色法MTT比色法的原理：

活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。

二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測定A值。第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)的其他指標(biāo)細(xì)胞大?。猴@微測微計(jì)法細(xì)胞重量：稱重法鮮重干重第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞固定與染色細(xì)胞固定蘇木精-伊紅染色Giemsa染色Feulgen染色考馬斯藍(lán)染色免疫法細(xì)胞核染色：Hoechst、DAPI第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞污染混濁、pH異常改變、細(xì)胞外形模糊、漂浮的集落細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡化學(xué)物質(zhì)的污染非同種細(xì)胞污染微生物污染：細(xì)菌、真菌、支原體、病毒5.細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌污染培養(yǎng)液變黃，出現(xiàn)渾濁鏡下可見圓球狀顆粒漂浮預(yù)防和處理：青霉素、鏈霉素第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二真菌污染培養(yǎng)液一般不渾濁白色或黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)基表面光鏡觀察到菌絲預(yù)防和處理：抗真菌劑第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二支原體污染可透過濾膜無細(xì)胞壁細(xì)胞營養(yǎng)液仍清亮但變黃，細(xì)胞生長變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落，細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二污染的控制預(yù)防重新培養(yǎng)鑒別清除：抗生素、加溫、支原體特異性血清、共培養(yǎng)法、重新克隆法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法防止交叉污染第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二6.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇慢凍快融低溫保護(hù)劑：10%的甘油或二甲亞砜DMSO

細(xì)胞深低溫保存的基本原理：

-80℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。