藥物毒理學(xué)講座

藥物毒理學(xué)講座第1頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二內(nèi)容提要

●概述

●藥品臨床前毒性試驗

●藥效試驗研究的基本要求

●藥效學(xué)試驗舉例

第2頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二一、概述

(一)實驗設(shè)計

(designofexperiment,DOE)

良好的設(shè)計是順利進行科學(xué)研究和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的先決條件，也是獲得預(yù)期結(jié)果的重要保證。第3頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二設(shè)計包括專業(yè)設(shè)計和統(tǒng)計設(shè)計兩部分：

專業(yè)設(shè)計是從各專業(yè)角度考慮實驗的科學(xué)安排，是基礎(chǔ)。包括選題，建立假說，確定研究對象和技術(shù)方法等；

統(tǒng)計設(shè)計則是從統(tǒng)計學(xué)角度，考慮設(shè)計的科學(xué)性和邏輯性，使研究結(jié)果具有重現(xiàn)性，更可靠，更科學(xué)，經(jīng)得起時間的考驗。第4頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二(二)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究種類

●臨床研究

●流行病學(xué)研究

●動物實驗研究第5頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二(三)研究深度廣度層次●

整體→系統(tǒng)→器官→組織

→細胞→亞細胞→分子水平●

個體群體●

體外

體內(nèi)●

宏觀微觀第6頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二(四)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的基礎(chǔ)學(xué)科和方法學(xué)

●衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)

●流行病學(xué)

●衛(wèi)生毒理學(xué)第7頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(五)毒理學(xué)及其相關(guān)術(shù)語

1.

毒理學(xué)(toxicology)

是研究化學(xué)物質(zhì)對機體的生物學(xué)作用及其機理的學(xué)科；

研究化學(xué)物質(zhì)對機體的有益作用，即通過影響機體器官的生理功能或細胞代謝活動達到防治疾病的目的，屬藥物學(xué)范疇；

研究化學(xué)物質(zhì)對機體的有害作

用及其防護措施，屬預(yù)防醫(yī)學(xué)范疇。第8頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2.外源化學(xué)物(xenobiotics)：

以前叫外來化合物，指存在于人類生活的外界環(huán)境中、可能與機體接觸并進入機體的化學(xué)物質(zhì)；它們并非人體的組成成分，也非人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，也不是維持正常生理功能和生命所必需的物質(zhì)，但可由外界環(huán)境經(jīng)一定環(huán)節(jié)和途徑與機體接觸并進入機體，在體內(nèi)呈現(xiàn)一定的生物學(xué)作用。確切地說，應(yīng)稱為“外來生物活性物質(zhì)”。須強調(diào)：包括“藥物”。第9頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二外源化學(xué)物包括：

醫(yī)藥

農(nóng)藥

工業(yè)化學(xué)物

環(huán)境污染物

食品添加劑

產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物：如化妝品、洗滌劑等

與外源化學(xué)物相對應(yīng)的概念是內(nèi)源活性化合物：指機體代謝過程中所形成的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。第10頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二3.

毒物(poison)

指在一定條件下，以較小劑量進入機體就能干擾正常的生化過程或生理功能，引起暫時或永久性的病理改變，甚至危及生命的化學(xué)物質(zhì)。

“毒物”與“非毒物”的概念是相對的。第11頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

4.毒性(toxicity)化學(xué)物能夠?qū)C體造成損害的能力，稱為毒性。

在同等劑量下，化學(xué)物質(zhì)對機體損害能力越大，其毒性越高。相對于同一損害指標，需要劑量越小的化學(xué)物質(zhì)，其毒性越大。第12頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二如同“毒物”和“非毒物”是相對的一樣，化學(xué)物質(zhì)的毒性高低具有相對意義。

對于毒性，一定要強調(diào)“量”的概念。任何化學(xué)物質(zhì)，只要達到一定的劑量，對機體都具有毒性，而低于某一劑量水平時，則不具有毒性。

如人體必需的微量元素Se、食鹽等；

毒性大的非人體必需化學(xué)物，在某一劑量范圍內(nèi)對機體不呈現(xiàn)損害作用，有的反而對某種疾病有治療作用，如As、Pb。

因此，劑量(dose)是化學(xué)物質(zhì)毒性的決定因素。第13頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)物質(zhì)的毒性除主要取決于劑量外，還與化學(xué)物對機體的作用條件(如接觸途徑、接觸方式：包括接觸次數(shù)、時間、間隔等)、理化特性(如溶解度、分散度、揮發(fā)度、比重、硬度)、環(huán)境因素(如氣溫、氣濕)、宿主因素(如物種、品系、性別、年齡、遺傳素質(zhì)、免疫水平、健康狀況、營養(yǎng)狀況)等有關(guān)。

因此，探討化學(xué)物對機體的生物學(xué)作用，關(guān)鍵是作用劑量和作用條件。即在嚴格控制條件下通過實驗研究(動物實驗)觀察藥物對機體及其組成部分的作用規(guī)律及其原理。第14頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二★

5.半數(shù)致死劑量

(medianletheldose,LD50)，或半數(shù)致死濃度(LC50)：指化學(xué)毒物能夠引起受試對象死亡一半所需要的劑量或濃度。又稱致死中量。為一統(tǒng)計量。

毒物的毒性大小，通常用動物急性毒性試驗所得出的LD50或LC50來表示?；瘜W(xué)毒物的急性毒性與LD50呈反比，即急性毒性越大，LD50的數(shù)值越小。

經(jīng)口、經(jīng)皮毒性用LD50表示，單位mg/kg·BW)；

吸入毒性或?qū)λ鷦游锏亩拘杂肔C50表示，單位mg/m3或mg/L。第15頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

LD50或LC50是評價化學(xué)毒物急性毒性大小最重要的參數(shù)，也是對不同化學(xué)毒物進行急性毒性分級的基礎(chǔ)標準。我國農(nóng)藥的急性毒性分級級別經(jīng)口LD50(mg/kg·WB)經(jīng)皮LD50(mg/kg·WB)4h吸入LC50(mg/m3)2h劇毒＜5＜20＜20高毒5~20~20~中等毒50~500200~2000200~2000低毒＞500＞2000＞2000第16頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級級別大鼠口服LD50(mg/kg·WB)相當于人的致死劑量(mg/kg·WB)(g/人)極毒＜1稍嘗0.05劇毒1~50500~40000.5中等毒51~5004000~300005低毒501~500030000~25000050實際無毒5001500000500無毒＞15000＞5000002500第17頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二反映化學(xué)物質(zhì)急性毒性大小的指標還有：

最大無作用劑量(NOEL)；

最小有作用劑量(minimaleffctlevel，MEL)，又叫中毒閾劑量(thresholddose)

，或中毒閾值，或毒性閾值；

最大耐受劑量(maximaltolerancedose,MTD,LD0)

最小致死劑量(LD1)；

絕對致死劑量(LD100)。

第18頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

6.劑量—反應(yīng)關(guān)系(dose-responserelationship)表示化學(xué)毒物的劑量與某一群體中質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生率之間的關(guān)系。

7.

劑量—效應(yīng)關(guān)系(dose-effectrelationship)表示化學(xué)毒物的劑量與個體

或群體中發(fā)生的量效應(yīng)強度

之間的關(guān)系。第19頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

安全系數(shù)種屬差異,動物實驗,外推到人。

試驗組不同劑量組

陰性對照組

陽性對照組為何設(shè)陰性、陽性對照組？

樣本含量原則：既符合統(tǒng)計學(xué)要求,又不致人力、物力、財力、時間的浪費。

統(tǒng)計學(xué)處理計量資料;計數(shù)資料第20頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二醫(yī)藥藥效學(xué)農(nóng)藥研究產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物毒理學(xué)(五)

藥物研究●藥效學(xué)研究●毒理學(xué)研究兩者均須通過動物實驗、流行病學(xué)、臨床研究方法進行研究，但毒理學(xué)研究主要采用動物實驗。第21頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二(六)

毒理學(xué)安全性評價

我國現(xiàn)有的毒理學(xué)安全性評價程序：

《食品安全性毒理學(xué)評價程序》

《農(nóng)藥安全性毒理學(xué)評價程序》

《新藥(農(nóng)藥)毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則》

《化妝品安全性毒理學(xué)評價程序》

《化學(xué)品毒性鑒定管理規(guī)范》(入世為與國際接軌頒布)

實驗室研究質(zhì)量規(guī)范(goodlaboratorypractice,GLP)，對毒性鑒定機構(gòu)的認證、實驗室要求作出明確規(guī)定。第22頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二對不同化學(xué)品(食品添加劑、藥物、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學(xué)物等)，由于接觸方式、途徑、劑量不同，按照不同的國家標準，采用不同行業(yè)規(guī)范程序進行評價。第23頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二毒理學(xué)安全性評采用分階段試驗的原則(考慮急性危害、慢性危害、遠期危害)。各階段試驗之間有關(guān)聯(lián)，要按順序進行。

如急性毒性實驗是所有毒理學(xué)實驗的基礎(chǔ)；

慢性毒性實驗的劑量、觀察指標的選擇要參考亞慢性毒性實驗的結(jié)果。

根據(jù)前一階段的實驗結(jié)果，判斷是否進行下一階段的實驗。第24頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

不同階段的毒理學(xué)試驗項目

我國現(xiàn)有毒理學(xué)評價程序多數(shù)為4個階段?！痘瘖y品安全性毒理學(xué)評價程序》為5個階段。

新藥研究分為全身用藥的毒性試驗、局部用藥的毒性試驗、特殊毒理研究，三部分。

化學(xué)物的種類不同，用途不同，試驗方法和先后順序不同(如化妝品、食品，口皮急毒順序不同)。第25頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

第一階段，包括：

?

急性毒性試驗；

?

局部毒性試驗。

目的：主要是測定LD50或LC50，并進行急性毒性分級，為其它試驗提供劑量參考依據(jù)，并推測靶器官。

農(nóng)藥、化裝品要進行

?

皮膚、黏膜刺激試驗；

?

眼刺激試驗；

?

皮膚致敏試驗；

?

皮膚光毒試驗；

?

光變態(tài)反應(yīng)試驗。第26頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二第二階段，一般包括：

?

蓄積試驗；

?

致突變試驗。

目的：了解與受試物多次接觸后體內(nèi)的蓄積情況以及可能的危害，并判斷是否具有致突變性進而估計致癌性。

蓄積試驗，以死亡為指標，有一定局限性，目前有些評價程序已經(jīng)去掉。

致突變試驗，包括多種組合，以觀察不同的遺傳終點。第27頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二某些受試物在第一、第二階段試驗后，可決定是否進行下一階段的試驗。

如引進產(chǎn)品、生產(chǎn)工藝，國外已經(jīng)登記注冊，毒性資料全面，其質(zhì)量規(guī)格、生產(chǎn)工藝、與國外產(chǎn)品一致，進行第一階段和第二階段結(jié)果與國外一致，可以不進行第三、第四階段試驗。第28頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

第三階段，包括：

?亞慢性毒性試驗；

?生殖及發(fā)育毒性試驗；

?代謝試驗。

亞慢性毒性試驗?zāi)康模捍_定反復(fù)接觸受試物所引起的毒性效應(yīng)、強度、靶器官，初步估計NOAEL或LOAEL，為慢性毒性試驗和致癌試驗提供劑量、指標參考依據(jù)。

生殖發(fā)育毒性試驗包括：致畸試驗；繁殖試驗。目的：觀察對生殖過程的影響。

代謝試驗?zāi)康模毫私馐茉囄镌隗w內(nèi)的吸收、分布、消除情況，判斷蓄積性。第29頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

第四階段，包括：

?慢性毒性試驗；

?致癌試驗。

目的：獲得NOAEL或LOAEL，

為制訂衛(wèi)生標準提供參考數(shù)據(jù)。

特點：時間長、費人力物力。第30頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(七)藥物毒理學(xué)研究的發(fā)展

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)的進步和發(fā)展，研制和開發(fā)了大量新藥，對醫(yī)治人類疾病,保障人類健康起到了巨大作用。

但由于1961年反應(yīng)停(thalidomide)藥害事件發(fā)生，使28國家中出生了8000多短肢畸形兒，引起世界各國極大關(guān)注，使醫(yī)學(xué)界首次認識到對母體安全的化學(xué)藥物對胎兒產(chǎn)生不可逆損傷。由此揭開藥物和其它環(huán)境化學(xué)毒物致畸的研究序幕。人們在要求藥效的同時，更注意其安全性。第31頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二一種藥物的藥理概況，決定于臨床前的藥理和毒性研究，在供使用前必需了解預(yù)期藥效、藥理性質(zhì)、毒性作用，有助于顯示其使用安全性。藥物的安全性，是保證藥品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，隨著新藥的國際化，國際間相互利用安全性試驗數(shù)據(jù)也日益增加。第32頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二為此，英國1968年頒布藥品法，1971年成立了藥物檢定機構(gòu)和藥物安全委員會。此后，在藥物市場經(jīng)濟推動下，許多發(fā)達國家開始重視藥物和其它化學(xué)品對人類生殖的影響，首先是致畸性(teratogenicity)，WHO于1967年在國際疾病分類中把先天缺陷列為第14項，分20大類、133小類。同時，研究懷孕至出生之間胚胎/胎兒異常發(fā)育的畸胎學(xué)(teratology)創(chuàng)立。1981年OECD(經(jīng)濟合作和發(fā)展組織)制定了“化學(xué)物質(zhì)毒性試驗指導(dǎo)原則”，該指導(dǎo)原則不僅對藥品也包括一般產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物質(zhì)，使毒性試驗規(guī)范化。第33頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二第34頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二第35頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二第36頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二第37頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(七)新藥研究過程

大致可分三步：即臨床前研究、臨床研究和售后調(diào)研。

1.臨床前研究

用動物試驗進行系統(tǒng)藥理研究和急慢性毒理觀察，對于具有選擇性藥理效應(yīng)的藥物，在進行臨床試驗前，還需測定該藥物在動物體內(nèi)的吸收、分布及消除過程(藥代動力學(xué))，故臨床前研究目的是弄清新藥的作用譜(藥效)及可能發(fā)生的毒性反應(yīng)(毒作用特點)。第38頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2.臨床研究

首先從10～30名志愿者中找出安全劑量(依據(jù)動物試驗結(jié)果，安全系數(shù))，再選有特異特征病人隨機分組，設(shè)立已知有效藥物及空白安慰劑雙重對照(陽、陰性對照),對治療結(jié)果統(tǒng)計分析，判斷其療效。

3.售后調(diào)研

重點了解長期使用后出現(xiàn)的不良反應(yīng)和遠期療效(流行病學(xué)研究)。第39頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二(八)新藥藥理毒理研究的技術(shù)要求

新藥的藥理毒理研究包括主要藥效學(xué)、一般藥理學(xué)、藥代動力學(xué)及毒理學(xué)研究等。第40頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二新藥的藥效研究，以醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運用現(xiàn)代科學(xué)方法，制定具有醫(yī)藥特點的試驗方案，根據(jù)新藥的功能主治，選用或建立相應(yīng)的動物模型和試驗方法，其目的是對新藥的有效性評價提供科學(xué)依據(jù)。

新藥的毒理研究包括急性毒性、長期毒性和特殊毒性試驗等，其目的是對新藥的安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。第41頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

基本要求

1.試驗主要負責人應(yīng)具有藥理毒理專業(yè)高級技術(shù)職稱和有較高的理論水平、工作經(jīng)驗與資歷。確保試驗設(shè)計合理，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果可信，結(jié)論判斷準確。試驗報告應(yīng)有試驗負責人簽字及單位蓋章。

2.受試藥物應(yīng)處方固定、制備工藝及質(zhì)量基本穩(wěn)定。

3.從事新藥安全性研究的實驗室應(yīng)符合國家藥品監(jiān)督管理局《藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(GLP)的要求，藥理研究也可參照實行。第42頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

全身性用藥的毒理試驗

1．急性毒性試驗

觀察一次給藥后，動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)并測定其半數(shù)致死量(LD50)。

要用兩種以上給藥途徑(包括推薦臨床研究的給藥途徑，溶于水的藥應(yīng)當測定iv的LD50)。給藥后至少觀察7d，觀察到動物有毒性反應(yīng)時應(yīng)進行肉眼尸檢，記錄所有病變。存活24h或更長時間的處理動物，當尸檢發(fā)現(xiàn)有病變組織時，應(yīng)對該組織進行鏡檢。第43頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2．長期毒性試驗

觀察動物因連續(xù)用藥而產(chǎn)生的毒性反應(yīng)、中毒時首先出現(xiàn)的癥狀及停藥后組織和功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況。第44頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(1)動物：至少兩種動物(包括嚙齒類和非嚙齒類)，嚙齒類常用大白鼠，年齡為6W，飼養(yǎng)觀察1W后使用，動物數(shù)按毒性試驗時間的長短決定，如毒性試驗時間＜90d，每劑量組為雌雄各10只。如毒性試驗時間＞90d，每劑量組為雌雄各20只。非嚙齒類常用狗，年齡為4~6月，每劑量組為雌雄各2只。對照組和試驗組的動物數(shù)要相等。第45頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(2)劑量：常用三個劑量，大動物也可用兩個劑量。在試驗過程中，高劑量組應(yīng)有部分動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡(≯20％)，低劑量組應(yīng)當略高于藥物對動物的有效量或臨床試驗用的劑量而不出現(xiàn)任何觀察指標的異常。第46頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(3)給藥途徑：注射用藥的給藥途徑應(yīng)與推薦臨床試驗的給藥途徑相同，口服給藥最好采用灌胃法。第47頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(4)試驗周期：一般參考推薦臨床試驗的用藥持續(xù)時間考慮，即動物試驗連續(xù)給藥期必須為臨床試驗給藥期的3~4倍。例如，臨床試驗給藥期為1~3d者，毒性試驗給藥期為2W。7d者，為4W。30d者，為3月。＞30d者，毒性試驗給藥期至少半年。

試驗周期在半年以上的新藥，可在長期毒性試驗進行3個月后、未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)的情況下，申請進行第Ⅰ期臨床試驗。第48頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(5)觀察指標：一般體征、體重、外觀、行為、尿常規(guī)、血常規(guī)、肝腎功能及重要器官的肉眼觀察和病理檢查，必要時作骨髓檢查，血液生化，大動物應(yīng)檢查心率和心電圖變化。凡有可能引起眼、耳毒性的藥物，應(yīng)增加眼、耳毒性檢查指標。有些藥物尚需研究對酸堿平衡、水鹽代謝的影響。第49頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二產(chǎn)生毒性反應(yīng)的新藥至少應(yīng)對高劑量組和對照組的動物在給藥期結(jié)束后繼續(xù)進行觀察，對引起不可逆性功能損害和組織病變的藥物，要慎重考慮臨床試驗問題。第50頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二對毒性較高、安全范圍較小的特殊品種新藥，如擬進行臨床試驗，最好通過研究找出一種解救藥，以備過量中毒時使用。第51頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二有的新藥還應(yīng)根據(jù)其藥理性質(zhì)和用途，觀察對注射部位(皮下、肌肉、血管)的刺激性，注射用生化制品應(yīng)進行熱原、異性蛋白及過敏試驗。第52頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(二)局部用藥毒性試驗

局部用藥(如呼吸道吸入以及粘膜、皮膚用藥等)，大都可以被吸收。因此，局部用藥應(yīng)先進行局部吸收試驗，根據(jù)藥物從局部吸收的程度，考慮進行全身性用藥的各項試驗。根據(jù)用藥方法，對用藥部位要進行局部刺激性試驗，用肉眼觀察及組織切片的鏡檢，測試刺激性(即炎癥)的發(fā)展和恢復(fù)情況。第53頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

1．皮膚用藥進行完整和破損皮膚的毒性試驗以及皮膚致敏試驗，除嬰兒皮膚用藥應(yīng)使用剛成年動物外，其余均用成年動物?？蛇x用家兔、豚鼠或大鼠。至少應(yīng)設(shè)三個劑量組，每組動物數(shù)≮3只，以觀察與劑量相關(guān)的毒性反應(yīng)。觀察期一般在停止敷用后不超過14d。第54頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2．滴鼻劑和吸入劑進行呼吸道(包括肺部)的局部刺激性和毒性試驗。大鼠或豚鼠。每一個濃度組至少10只動物(雌雄各半)，至少設(shè)3個濃度組。接觸吸入劑的時間不少于4h。觀察期一般為14d。第55頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

3．滴眼劑觀察對眼結(jié)合膜和眼球的刺激作用。家兔為首選，至少用3只家兔。液體制劑的劑量一般每次用0.1ml，軟膏等制劑每次≯100mg。觀察期一般在停止給藥后21d內(nèi)，以觀察出現(xiàn)反應(yīng)的可逆性和不可逆性。第56頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

4．局部作用于直腸、陰道的制劑，進行對作用部位的刺激及局部毒性試驗。第57頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(三)特殊毒理研究

1．致突變試驗根據(jù)受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及對遺傳物質(zhì)作用終點(基因突變和染色體畸變)的不同。要求新藥必須做以下三項試驗：第58頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(1)微生物回復(fù)突變試驗

菌株：組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌四株(TA97、TA98、TA100、TA102)，亦可采用大腸桿菌(E.Coli)WP2若干株(大腸桿菌試驗)。第59頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

劑量選擇：決定受試物最高劑量的標準是細菌毒性和溶解度。一般最大劑量可達5mg/皿。受試物至少應(yīng)有5種不同的劑量，否則應(yīng)說明選擇劑量的理由。

代謝活化：應(yīng)有誘導(dǎo)劑處理后的哺乳動物肝臟微粒體(S9)進行體外代謝活化試驗，即在加S9混合物和不加S9混合物平行的條件下測試。

對照組：用溶媒作陰性對照，用已知突變原作陽性對照。第60頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

結(jié)果判定：受試物的回復(fù)突變菌落數(shù)的增加與劑量相關(guān)并有統(tǒng)計學(xué)意義，或至少某一測試點呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的陽性反應(yīng)時記為陽性。第61頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(2)哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗

細胞：哺乳動物原代或傳代培養(yǎng)細胞。

劑量：至少應(yīng)有三種不同劑量，高劑量以50％細胞生長抑制濃度為基準，否則應(yīng)說明選擇劑量的理由。

標本制作時間：藥物與細胞接觸后應(yīng)有適當時間，最好包括整個細胞周期，通常在藥物處理后24和48h制作染色體標本。第62頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

代謝活化：應(yīng)用適當?shù)拇x活化法。

對照組：用溶媒作陰性對照，已知突變原作陽性對照。

鏡檢：每種濃度至少觀察100個中期分裂相細胞的染色體結(jié)構(gòu)的異常及多倍體的出現(xiàn)率。

結(jié)果判定：受試物誘發(fā)的染色體畸變出現(xiàn)率較陰性對照有統(tǒng)計學(xué)意義的增加，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時記為陽性，同時標明異常細胞出現(xiàn)的頻率和種類。第63頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(3)體內(nèi)試驗：一般選用微核試驗，但作用于生殖系統(tǒng)的藥物進行顯性致死試驗等。第64頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

1)嚙齒類動物微核試驗

動物：一般用小鼠，每組10只性成熟動物(♀♂各半)或至少6只性成熟♂動物。

給藥劑量及途徑：至少采用三種劑量，最高劑量以1/2LD50為基準，腹腔和/或口服一次給藥，必要時可連續(xù)給藥、否則應(yīng)說明選定劑量的理由。

對照組：用溶媒作陰性對照，已知能誘發(fā)微核陽性的物質(zhì)作陽性對照。第65頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

標本制作：給藥后18~30h或12~72h處死動物，取骨髓，離心，涂片，Giemsa染色或吖啶橙染色。

鏡檢：每只動物至少觀察計數(shù)1000個多染紅細胞和正染紅細胞的比率。

結(jié)果判定：微核細胞出現(xiàn)的頻度與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義的增加，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時，或同一劑量有重復(fù)性并有統(tǒng)計學(xué)意義時記為陽性。第66頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2)嚙齒類動物顯性致死試驗

動物：性成熟的嚙齒類動物，一般采用小鼠。每組至少15只♂鼠。

給藥劑量及途徑：至少采用三種劑量，但在初期評價中單劑量或二種劑量即可。高劑量以30d連續(xù)給藥使100％動物生存的最大耐受量為基準?？诜蚋骨蛔⑸淇刹捎靡淮谓o藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥5d或連續(xù)給藥6W的方法之一。第67頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

交配方法：給藥的♂♂動物以適當?shù)臅r間間隔依次與未給藥的♀動物交配，交配時間取決于給藥方式，一般一次或連續(xù)給藥5d的動物，以最后給藥后6W內(nèi)為交配時間；連續(xù)給藥6W的動物以最后給藥后1W內(nèi)為交配時間。第68頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

對照組：用溶媒作陰性對照，已知能誘發(fā)顯性致死陽性物質(zhì)作陽性對照。但在同一實驗室，對同一品系的動物，可不設(shè)陽性對照。

觀察指標：交配的♀動物在妊娠后期剖腹，觀察子宮內(nèi)胚胎著床數(shù)，生存胎仔數(shù)，死亡胎仔數(shù)及未著床數(shù)。顯性致死率以DL表示：

DL(100％)＝[1－(試驗組妊娠鼠的平均生存胎仔數(shù)/陰性對照組妊娠鼠的平均生存胎仔數(shù))]×100第69頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

結(jié)果判定：死亡胎仔數(shù)的增加，胚胎著床總數(shù)的減少，或未著床胚胎數(shù)的增加，生存胎仔總數(shù)減少，這些結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義并有劑量反應(yīng)關(guān)系時記為陽性顯性致死效應(yīng)。

當上述三項致突變試驗結(jié)果難以下結(jié)論時，可選擇其他補充試驗予以確證。第70頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2．生殖毒性試驗所用藥物至少應(yīng)有2~3種劑量并設(shè)對照組。高劑量可產(chǎn)生輕度毒性反應(yīng)，低劑量應(yīng)為人臨床擬用劑量的若干倍。給藥途徑原則上與推薦臨床應(yīng)用的給藥途徑相同，口服制劑應(yīng)用灌胃法。第71頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(1)一般生殖毒性試驗

動物：一種或一種以上試驗動物，如用小鼠或大鼠每組♀♂各20只以上。

給藥時期：選擇性成熟的動物，交配前♂動物連續(xù)給藥60d以上，♀動物連續(xù)給藥14d。♀動物在確定已經(jīng)交配后繼續(xù)給藥至多數(shù)胚胎器官發(fā)生期。第72頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

檢查：給藥的♀動物與給藥的♂動物同籠飼養(yǎng)期限最多2W。必要時給藥動物可以和非給藥動物分別交配。已交配的雌性動物，推定其妊娠末期及時解剖，觀察妊娠的確立、胎兒的吸收和死亡及子宮內(nèi)活胎的發(fā)育情況，并進行形態(tài)學(xué)檢查(性別、外表及內(nèi)部器官的形態(tài)學(xué)觀察及骨骼透明標本的檢查)，必要時進行組織學(xué)和組織化學(xué)的詳細檢查。給藥的♂動物及未交配上的♀鼠均作剖檢，必要時進行病理組織學(xué)檢查。第73頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(2)致畸胎試驗

動物：至少一種動物。一般采用小鼠或大鼠，每組15~20只孕鼠，家兔每組8~12只孕兔。

劑量：至少有2~3種劑量。并另設(shè)對照組，高劑量可有輕度毒性反應(yīng)，低劑量應(yīng)以擬議中的治療量的某些倍量。

給藥途徑：與推薦臨床應(yīng)用的給藥途徑相同，口服制劑應(yīng)用灌胃法。

給藥時期：胚胎的器官形成期。第74頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

檢查：全部動物在妊娠末期剖檢，觀察妊娠的確立，有無死胎和吸收胎及子宮內(nèi)活胎的發(fā)育情況，并進行形態(tài)學(xué)檢查(性別、外表及內(nèi)部器官的形態(tài)學(xué)觀察及骨骼透明染色標本的檢查)，必要時進行組織學(xué)和/或組織化學(xué)的詳細檢查。第75頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二某些新藥需要觀察其對子代的影響。動物數(shù)相應(yīng)增加孕鼠10只，使其自然分娩，觀察下一代直至成年。檢查新生動物的存活、生長及發(fā)育情況，包括行為、生殖功能和其他異常癥狀。必要時還可對給藥的♀動物長期觀察其生殖、受孕、分娩及次子代的情況。第76頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

結(jié)果處理：將數(shù)據(jù)匯總成表，盡量將全部觀察的結(jié)果采用適當?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法分析及評價。第77頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(3)圍產(chǎn)期毒性試驗

動物：小鼠或大鼠，每組15~20只孕鼠，家兔每組8~20只孕兔。

給藥時期：妊娠后期及整個泌乳期。

檢查：所有♀動物自然分娩，觀察下一代直至成年，檢查其新生后存活、生長和發(fā)育情況，其中包括行為、生殖功能及其他異常癥狀。必要時還可對給藥的♀動物長期觀察其生殖、受孕、分娩及次子代的情況。第78頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

3．致癌試驗在選擇動物的種系時，應(yīng)考慮其對感染疾患的抵抗性、壽命、自發(fā)腫瘤的頻度系對致癌物的敏感性。同一藥物的致癌性預(yù)備試驗及致癌試驗應(yīng)該用同一飼養(yǎng)場飼養(yǎng)的同一種和系的動物。嚙齒動物的給藥時間，最好在斷乳后盡早開始。第79頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(1)致癌試驗的預(yù)備實驗：應(yīng)由急性毒性試驗決定亞急性毒性試驗的最高劑量，由亞急性毒性試驗決定致癌試驗的最高劑量，此劑量應(yīng)具有：實驗和對照組之比，體重增長抑制＜10％；無中毒死亡動物；一般形態(tài)變化不大。第80頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二嚙齒類動物每組♀♂各10只，設(shè)三個試驗組及一個對照組。給藥途徑應(yīng)與進行致癌試驗時準備采用的途徑一致，連續(xù)給藥90d。對有慢性蓄積性效應(yīng)的藥物，需延長給藥期。藥物混入飼料或飲水中給藥的方式，要定期測定飼料或飲水的消耗量，以推算出藥物的攝取量。第81頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二每天觀察動物的一般情況，每周測量動物體重，對死亡動物及試驗期末的動物均需作大體解剖，并作病理解剖記錄。肉眼觀察后，認為有病變或可疑病變的臟器進行病理組織學(xué)檢查。第82頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(2)致癌試驗

動物：試驗組和對照組動物♀♂各50只以上。

劑量：至少應(yīng)有三種以上劑量，一定要有溶媒或賦形劑對照組。

給藥期：大鼠為24月以上，小鼠、地鼠為18月以上。第83頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

觀察指標：對所有動物每天應(yīng)觀察一般癥狀，開始時每周測一次體重和攝食量，第13W后，至少每4W測一次。應(yīng)盡量減少腫瘤以外的死亡率。大鼠在試驗24個月，小鼠、地鼠18個月時，各組的存活率不小于50％。試驗期末解剖或懷疑有血液疾患時，最好做末梢血液白細胞及紅細胞計數(shù)。第84頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二如果在試驗組和對照組肉眼觀察到有腫瘤性病變或可疑腫瘤病變時，則應(yīng)對以下器官進行病理組織學(xué)檢查：皮膚、乳腺、淋巴結(jié)、唾液腺、胸骨、脊椎及大腿骨(含有骨髓)、胸腺、氣管、肺及支氣管、心、甲狀腺及副甲狀腺、舌、食管、胃、十二指腸、大腸、小腸、肝、胰、脾、腎、腎上腺、睪丸、卵巢、性腺及其附屬器官、眼球、腦下垂體、脊髓及其它。第85頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二如果試驗組和對照組均無肉眼可見的腫瘤性病變，則對高劑量組的部分動物(1/2~1/3)的上述器官進行病理組織學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)有腫瘤病變則需對全部動物進行病理組織學(xué)檢查。第86頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

結(jié)果判斷：符合下列情況之一者判斷為陽性：①試驗組腫瘤陽性，對照組陰性；②試驗組和對照組均有腫瘤發(fā)生，但試驗組腫瘤發(fā)生率高于對照組；③試驗組腫瘤發(fā)生的部位多于對照組；④試驗組和對照組腫瘤的發(fā)生率雖無明顯差異，但試驗組腫瘤出現(xiàn)早。第87頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(3)評價：如果在一種動物中發(fā)現(xiàn)有明確的致癌作用，預(yù)示對人可能有致癌潛力。如果在所有動物中(最好兩種)都是陰性結(jié)果，則可判為陰性。第88頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二二、藥品臨床前毒性試驗★

(一)目的

剔除毒性大的化學(xué)物，找出發(fā)生不良反應(yīng)的靶器官和靶組織，以便在早期臨床試驗中注意觀察這些器官和組織的構(gòu)造及功能變化，最好還要找出這些不良反應(yīng)與劑量和療程間關(guān)系，毒性作用是可逆的，還是不可逆的，是可以預(yù)防的，還是不可避免的，如果能證實毒作用機制，就可以更精確地預(yù)測藥品對人體毒性(但要考慮其不良反應(yīng)是否與超劑量—反應(yīng)的界限，就會出現(xiàn)與藥理作用范圍內(nèi)的劑量缺乏聯(lián)系的毒性反應(yīng))。第89頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

(二)試驗原則

●單次給藥毒性試驗

●重復(fù)給藥毒性試驗

●生殖、發(fā)育毒性試驗

●致突變試驗

●致癌試驗

●皮膚過敏試驗

●皮膚光敏性試驗第90頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

1.單次給藥毒性試驗

又稱急性毒性，指一次給藥。

目的:一次給予受試物后，從質(zhì)與量兩方面證明其毒性。第91頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二動物物種選用原則★

①解剖結(jié)構(gòu)、生理生化、化學(xué)物

在體內(nèi)的代謝與人類近似；

②經(jīng)濟可行；

③有符合試驗要求的壽命長度；

④便于飼養(yǎng)管理。第92頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二常用毒理學(xué)試驗的動物選擇★

●一般毒性試驗常選大鼠、小鼠；

●眼刺激試驗常選家兔；

●皮膚刺激試驗常選家兔、豚鼠；

●

致敏試驗和光敏試驗常選豚鼠；

●

生殖發(fā)育毒性試驗常選大鼠；

●

致癌試驗常選大鼠……

第93頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

動物數(shù)量確定原則

即統(tǒng)計學(xué)中的樣本含量問題，既要符合統(tǒng)計學(xué)要求，又不致人力、物力、財力、時間的浪費。第94頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二動物性別確定原則

至少一種，♀♂各半。某些特殊試驗例外，如致癌試驗可只用♂性動物。第95頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

給藥途徑選擇原則★

與人類實際接觸途徑一致。藥物毒理學(xué)研究給藥途徑同臨床。

但：臨床po、iv，動物只iv。第96頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二單次給藥毒性試驗動物要求：兩種以上，嚙齒類動物(每組5只)，非嚙齒類(2只)，要求二級以上動物(即飼養(yǎng)于簡易屏障系統(tǒng)，無危害動物種群的微生物和寄生蟲,為我國當前的合格的標準實驗動物)。

性別：至少一種，♀♂各半。第97頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

途徑：臨床po、iv，動物只iv。

劑量：設(shè)計的劑量組能全面掌握毒性劑量范圍，要求能求出近似致死量足夠的劑量范圍，不一定LD50，非嚙齒類要求能觀察到出現(xiàn)明顯毒性癥狀的劑量范圍，并希望能顯示出劑量—反應(yīng)關(guān)系。(近似致死量：因用動物量少，劑距大，求出死亡率只能近似致死量，以xx～xxmg/kg范圍表示)。

觀察期：14d，死亡和存活動物均應(yīng)剖檢，異常者要做病理組織學(xué)檢查。第98頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二常用LD50計算方法

●Horn(霍恩)氏法(又叫平均移動法、劑量遞增法)

●寇氏法和改進寇氏法

●概率單位法

●序貫法(又叫平均數(shù)法、階梯法、上－下法)

●Bliss法(又叫最大似然性法)第99頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二LD50計算方法之—Horn氏法簡介

原理

Horn氏法，又叫平均移動法、劑量遞增法，是利用劑量對數(shù)與死亡率(反應(yīng)率)的轉(zhuǎn)換數(shù)(即幾率單位)呈直線關(guān)系而設(shè)計的方法。

優(yōu)缺點使用動物數(shù)少；可直接從Horn氏表查出LD50及其95％可信限，不需計算，甚為簡便。但LD50的95％可信區(qū)間范圍較大，方法精確度尚不夠。第100頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

Horn氏法設(shè)計原則★

4個劑量組；每組動物數(shù)相等；每組4只或5只；設(shè)計劑量時可根據(jù)化學(xué)物致死劑量范圍的寬窄應(yīng)用兩個劑量系列，其組距分別為2.15倍和3.16倍。根據(jù)每組動物數(shù)、組距和每組動物死亡數(shù)，即可從Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。

見《MicrosoftPowerPoint－霍恩法.ppt》第101頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

2.重復(fù)給藥毒性試驗(包括亞急性和慢性毒性試驗)

目的：觀察劑量與反應(yīng)的時間關(guān)系和首次出現(xiàn)的毒性變化及停藥后組織和功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況。

動物和性別：同單次給藥毒性試驗。

動物數(shù)：♀♂各半,每組≥10只(非嚙齒類3只),如實驗中要活殺,則要追加動物數(shù)。若毒性試驗＞90d,♀♂各20只。

途徑：同臨床。

給藥期：見表1，一般約為臨床試驗用藥的3～9倍。第102頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二表1重復(fù)給藥毒性試驗給藥期臨床擬給藥期動物試驗給藥期(月)單次或連續(xù)1W1＞1W或4W內(nèi)連續(xù)給藥3＞1月或6個月連續(xù)給藥6＞6個月或蓄積性12第103頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

劑量組別：至少3組(高劑量組有部分動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡≯20％)(毒性反應(yīng)劑量、無毒性反應(yīng)劑量、臨床試用劑量)。對照組：溶媒對照,必要時設(shè)空白、陽性對照。觀察指標：①一般狀況：(體重、攝食量、飲水量)；②血、尿常規(guī)；③生理指標：如心、視、聽等功能；④大體解剖、病理組織學(xué)檢查。第104頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

3.生殖、發(fā)育毒性試驗將妊娠前到離乳期分為三個試驗階段：①妊娠前及妊娠初期；②胚胎器官形成期；③圍產(chǎn)期及授乳期)。以掌握對生殖、發(fā)育的影響。要求三個階段試驗動物種系要統(tǒng)一，應(yīng)選擇受孕率高、自畸率低、對陽性物敏感的動物。第105頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

⑴妊娠前及妊娠初期給藥試驗

動物：大鼠、小鼠任選一種(大鼠胎盤結(jié)構(gòu)更接近人)，♀♂各20只。

給藥途徑：同臨床。

劑量組別：3個劑量組、對照組(陽性、陰性、比較對照。后者指化學(xué)結(jié)構(gòu)或藥效與受試物相似的已知物質(zhì))。給藥期：♂出生后40d連續(xù)給藥60d以上，交配，直至交配成立止，♀成熟動物14d以連續(xù)給藥后交配，懷孕直到胚胎的器官形成初期為止,大鼠(受孕0～7d)小鼠(0～6d)。試驗方法：同致畸試驗。觀察身長、體重及頭顱、肢體等有無畸形。第106頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

⑵胚胎器官形成期給藥試驗

動物數(shù)：每組孕鼠30只以上。

給藥期：大鼠受孕后7～17d，小鼠6～15d。⑶圍產(chǎn)期及授乳期給藥

動物數(shù)：大小鼠每組20只以上。

給藥期：大鼠受孕后17～分娩后21d，小鼠受孕后15～分娩后21d，觀察子代至成年的存活、生長和發(fā)育(展)情況。第107頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

4.致突變試驗：

原則上要進行：①細菌回復(fù)突變試驗；②培養(yǎng)細胞的染色體畸變試驗；③嚙齒類動物的微核試驗(體內(nèi)試驗)。

第108頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

5.致癌試驗

凡長期使用的新藥或依其結(jié)構(gòu)和藥理作用懷疑致癌性應(yīng)進行試驗,但對用于罕見及難治疾病的藥物,并且在臨床使用,利大于弊時,可不受致癌性影響。

⑴試驗動物：應(yīng)考慮對疾病抵抗力、壽命、自發(fā)腫瘤發(fā)生率和已知對致癌性物質(zhì)的敏感性等。

第109頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

⑵試驗方法：依據(jù)單次給藥和重復(fù)給藥結(jié)果決定劑量。高劑量要求與對照組比較10％以內(nèi)體重增長受抑制，但不出現(xiàn)顯著的毒性變化，沒有中毒死亡，此結(jié)果可以通過預(yù)試驗獲得。

1)動物：2種以上，♀♂各半(多用大、小鼠)6W齡以下動物(最好同一周齡)。

2)動物數(shù)：♀♂各50只。

3)給藥途徑：同臨床。第110頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

4)劑量組：應(yīng)設(shè)3組以上：

①高劑量組按上述要求設(shè)劑量，低劑量原則上應(yīng)呈現(xiàn)藥效或根據(jù)臨床擬給藥劑量決定，中間組是高、低劑量的等比中項。

②當與臨床治療比較毒性很低時，高劑量可按臨床擬給藥劑量的100倍設(shè)計。

③低劑量應(yīng)是高劑量的10％以上，當其量顯著偏離臨床擬給藥量時，可設(shè)計不足高劑量10％的劑量。

④混入飼料或飲水中給藥(自然經(jīng)口攝入)時，前三個月每周測一次攝入量和飲水量，以后每三個月測一次，以計算受試物攝入量。

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5)對照組：陰性對照給受試物溶媒或乳化劑；空白對照。

6)給藥期：大鼠24～30月,小鼠18～24月，連續(xù)給藥，灌胃給藥可給5d停2d。

7)試驗期：大鼠最長30月,小鼠和倉鼠24月,當?shù)蛣┝拷M或?qū)φ战M動物累積死亡率達75％時,應(yīng)全部剖殺。實驗期間要求各組存活率≮50％。

8)試驗方法：稱體重前3月1次/W，以后每月1次，死亡動物及時剖檢(病理)，實驗結(jié)束應(yīng)剖檢高劑量組，發(fā)現(xiàn)靶器官以便有目的檢查。

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9)結(jié)果判斷

①試驗組腫瘤陽性,對照組陰性(有與無)；

②兩組均有腫瘤,試驗組>對照組(P<0.05)(多與少)；

③試驗組腫瘤發(fā)生部位多于對照組(部位多少)；

④兩組腫瘤發(fā)生率無差異,試驗組出現(xiàn)早(早與晚)。第113頁，共126頁，2023年，2月20日，星期二

6．皮膚過敏試驗(針對外用藥物)

1)劑型：液體、半固體可直接用，固體應(yīng)用水或溶媒濕潤后用。

2)動物：豚鼠，每組5只。

試驗組：①受試物涂敷組；②陽性對照(1-氯-2,4-二硝基苯)；③陰性對照(空白、基質(zhì)、乳化劑)。

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試驗步驟

①背部皮膚脫毛(2×4cm)；

②將蒸餾水、受試劑、溶劑0.1ml±對稱皮內(nèi)注射；

③1W后在皮膚注射部位涂敷月桂醇硫酸鈉(1％凡士林),次日在同一部位帖敷封包0.2ml/0.2mg(液/固)受試物;

④激發(fā)致敏結(jié)束2W后，同一部位帖敷受試物24h；

⑤評價：去帖敷后24、48h觀察皮膚反應(yīng),以紅斑、水腫程度、頻率與陽性對照、陰性對照比較。

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7．皮膚光敏性試驗

方法同皮膚過敏試驗，只是在致敏后3W，于豚鼠背部一側(cè)以錫紙遮光，以10Joales/cm2的紫外線照射。

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三、藥效試驗研究的基本要求

1.掌握藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化特性。

2.以整體動物體內(nèi)試驗為主，試驗動物應(yīng)符合國家規(guī)定的等級動物要求(二級，即清潔級動物：飼養(yǎng)于簡易屏障或隔離系統(tǒng)，應(yīng)排除對動物有危害的微生物和寄生蟲，即按我國國情采用的過渡級別。發(fā)達國家用三級，即無特定病原體動物)，必要時配合體外試驗，從不同層次證實其藥效，充分證實其主要治療作用以及較重要的其他治療作用。動物模型應(yīng)符合治療病征。

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3.觀測指標：應(yīng)選用特異性強、敏感性高、重現(xiàn)性好、客觀、定量或半定量的指標進行觀測，對實驗方法應(yīng)作詳細敘述。

4.給藥量及途徑

劑量：應(yīng)設(shè)兩個組,其中一個劑量相當于臨床劑量的2～5倍(小鼠10～15倍)，大動物可僅設(shè)一個劑量，藥效試驗量不應(yīng)高于長期毒性試驗劑量。

途徑：二種，一種與臨床相同。

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5.對照藥：

空白對照：正常及模型動物對照組，必要時設(shè)溶媒對照。

陽性藥物對照：應(yīng)選擇藥典受載或部頒標準或正式批準生產(chǎn)的藥物