生化教研室的學(xué)習(xí)教案

生化教研室的學(xué)習(xí)教案第1頁(yè)/共118頁(yè)第一節(jié)DNA的復(fù)制第二節(jié)基因突變第三節(jié)DNA的修復(fù)系統(tǒng)主要學(xué)習(xí)內(nèi)容第2頁(yè)/共118頁(yè)復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA第一節(jié)DNA的復(fù)制第3頁(yè)/共118頁(yè)

半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)

復(fù)制的高保真性(highfidelity)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)

一、DNA復(fù)制的一般特征第4頁(yè)/共118頁(yè)概念：

DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。1、半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)（一）半保留復(fù)制、復(fù)制子、復(fù)制叉、雙向復(fù)制第5頁(yè)/共118頁(yè)按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。

半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。第6頁(yè)/共118頁(yè)密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果第7頁(yè)/共118頁(yè)AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

復(fù)制的基本規(guī)律————第8頁(yè)/共118頁(yè)2、復(fù)制起點(diǎn)（originofreplication，ori或O）DNA復(fù)制時(shí)總是從一個(gè)特定的位置開始，這一位置稱為復(fù)制起點(diǎn)。多數(shù)是富含A·T配對(duì)的區(qū)域。

富含A·T配對(duì)的區(qū)域經(jīng)常處于開發(fā)與閉合的動(dòng)態(tài)平衡之中，稱為DNA的呼吸作用。3、復(fù)制子（replicon）兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。4、復(fù)制叉（replicationfork）第9頁(yè)/共118頁(yè)5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’真核生物每個(gè)染色體上形成多個(gè)復(fù)制子。第10頁(yè)/共118頁(yè)大多數(shù)原核和真核生物復(fù)制時(shí)，DNA都是從固定起始點(diǎn)開始向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。5、復(fù)制方向（1）雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）（2）單向復(fù)制

從特定的位置開始，單方向進(jìn)行復(fù)制。（3）不對(duì)稱的雙向復(fù)制第11頁(yè)/共118頁(yè)6、復(fù)制終點(diǎn)（1）環(huán)狀DNA復(fù)制終點(diǎn)——固定的復(fù)制終點(diǎn)（2）線狀DNA復(fù)制終點(diǎn)——形成一個(gè)大分子串聯(lián)體（多聯(lián)體）。如噬菌體病毒。第12頁(yè)/共118頁(yè)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)第13頁(yè)/共118頁(yè)（二）DNA復(fù)制的酶系1、使DNA鏈解離的酶

解旋酶單鏈DNA結(jié)合蛋白

DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）第14頁(yè)/共118頁(yè)（1）解螺旋酶(helicase)（DnaB蛋白）：——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈（2）單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

E.Coli中的SSB以四聚體形式存在，與DNA結(jié)合具有協(xié)同作用。DNA復(fù)制的酶學(xué)————第15頁(yè)/共118頁(yè)108

局部解鏈后（3）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

DNA復(fù)制的酶學(xué)————第16頁(yè)/共118頁(yè)解鏈過程中正超螺旋的形成第17頁(yè)/共118頁(yè)

拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅲ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ

分類DNA復(fù)制的酶學(xué)————第18頁(yè)/共118頁(yè)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶作用機(jī)制

DNA復(fù)制的酶學(xué)————第19頁(yè)/共118頁(yè)2、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性53外切活性35外切活性第20頁(yè)/共118頁(yè)（1）原核細(xì)胞中的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ第21頁(yè)/共118頁(yè)功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)，切除引物。DNA-polⅠ（109kD）53

聚合活性35外切活性53外切活性第22頁(yè)/共118頁(yè)DNApolⅠ利用3′→5′外切活性切除錯(cuò)配的堿基，同時(shí)利用5′→3′聚合活性補(bǔ)回正確的核苷酸，這種功能稱為即時(shí)校讀(proofread)。DNApolⅠ的5′→3′外切酶作用可以與其聚合作用同時(shí)發(fā)生，產(chǎn)生缺口平移(nicktranslation)、鏈的置換及模板轉(zhuǎn)轍現(xiàn)象。第23頁(yè)/共118頁(yè)堿基配對(duì)正確，DNApolⅠ無(wú)活性3′-5′外切活性5′-3′聚合活性DNApolⅠAGdCTPCG5′3′5′3′DNApolⅠ的即時(shí)校讀功能第24頁(yè)/共118頁(yè)5′5′5′5′5′5′5′5′5′3′3′3′3′3′3′帶有切刻的雙鏈切口平移鏈的置換鏈置換模板轉(zhuǎn)轍第25頁(yè)/共118頁(yè)323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸5′→3′聚合活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

第26頁(yè)/共118頁(yè)DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

第27頁(yè)/共118頁(yè)功能是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(900kD)第28頁(yè)/共118頁(yè)DNApolⅢ分子量為900KD，全酶由10種(α、ε、θ、τ、γ、δ

、δ′、β、κ、ψ)22個(gè)亞基構(gòu)成不對(duì)稱二聚體；

核心酶包含α、ε、θ亞基；α亞基分別催化領(lǐng)頭鏈與隨從鏈的合成；ε亞基有3′→5′外切酶活性及對(duì)堿基的選擇功能，θ亞基為裝配所必需；β亞基起著夾住模板又能使酶延模板滑動(dòng)的作用。第29頁(yè)/共118頁(yè)

DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ分子數(shù)/細(xì)胞400？20比活性低于polⅢ？比polⅠ大10倍以上分子量(kD)109120900分子組成單一肽鏈,有A至R？10種、22個(gè)亞基共18α-螺旋肽段不對(duì)稱二聚體5′→3′聚合活性＋＋＋5′→3′外切活性＋－－3′→5′外切活性＋＋＋＋基因突變后致死性可能不可能可能功能校讀不清楚在復(fù)制延長(zhǎng)中填補(bǔ)空隙修復(fù)合成催化新鏈合成切除引物原核生物的三種DNA聚合酶比較第30頁(yè)/共118頁(yè)（2）真核細(xì)胞中的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol第31頁(yè)/共118頁(yè)

真核生物的DNA聚合酶比較第32頁(yè)/共118頁(yè)3、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式第33頁(yè)/共118頁(yè)DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的功能第34頁(yè)/共118頁(yè)3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)

半不連續(xù)性復(fù)制（三）DNA的復(fù)制過程第35頁(yè)/共118頁(yè)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈（領(lǐng)頭鏈）。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后滯鏈（隨從鏈）。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

第36頁(yè)/共118頁(yè)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子二、原核生物的DNA復(fù)制第37頁(yè)/共118頁(yè)（一）復(fù)制的起始（二）復(fù)制的延長(zhǎng)（三）復(fù)制的終止復(fù)制過程：第38頁(yè)/共118頁(yè)需要解決兩個(gè)問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。（一）大腸桿菌基因組復(fù)制的起始原核生物的DNA復(fù)制——第39頁(yè)/共118頁(yè)E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.復(fù)制起始點(diǎn)第40頁(yè)/共118頁(yè)DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB35352.復(fù)制的引發(fā)——形成引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

第41頁(yè)/共118頁(yè)3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第42頁(yè)/共118頁(yè)

原核生物DNA復(fù)制的起始⑴DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在復(fù)制起始部位將DNA引入負(fù)超螺旋。⑵DnaA蛋白辨認(rèn)、結(jié)合于起始位點(diǎn)，并促使解鏈。⑶DnaB與DnaC復(fù)合物進(jìn)入，生成引發(fā)前體，然后

DnaB繼續(xù)發(fā)揮解鏈的作用。⑷SSB與解開的單鏈結(jié)合，穩(wěn)定和保護(hù)單鏈。⑸引物酶(DnaG)進(jìn)入并與引發(fā)前體結(jié)合生成引發(fā)體（解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA起始區(qū)）。⑹引發(fā)體中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。⑺DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Ⅱ型為主)在解鏈前方理順DNA

鏈，松弛正超螺旋。第43頁(yè)/共118頁(yè)第44頁(yè)/共118頁(yè)（二）復(fù)制的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

原核生物的DNA生物合成——第45頁(yè)/共118頁(yè)5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第46頁(yè)/共118頁(yè)

復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

第47頁(yè)/共118頁(yè)

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)以親代DNA單鏈為模板DNA新鏈生成需引物；遵循堿基配對(duì)規(guī)律（A=T，G≡C）

dNTP為原料5→3方向延長(zhǎng)第48頁(yè)/共118頁(yè)領(lǐng)頭鏈的合成第49頁(yè)/共118頁(yè)隨從鏈的合成第50頁(yè)/共118頁(yè)復(fù)制的延長(zhǎng)第51頁(yè)/共118頁(yè)原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）大腸桿菌基因組復(fù)制的終止第52頁(yè)/共118頁(yè)（一）真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始點(diǎn)三、真核生物的DNA復(fù)制

1、猴病毒SV40的復(fù)制起始點(diǎn)SV40基因組為5kb，雙鏈環(huán)狀DNA。只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，包括幾個(gè)必要的元件：①四個(gè)5′-GAGGC-3′序列，是大T抗原結(jié)合位點(diǎn)。②一個(gè)15bp的回文結(jié)構(gòu)，最早解鏈區(qū)域。③一個(gè)只有A-T組成的17bp區(qū)域，促進(jìn)解鏈。2、酵母的復(fù)制起始點(diǎn)——自主復(fù)制序列，11bp。第53頁(yè)/共118頁(yè)?真核生物染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。1、解鏈——復(fù)制的起始需要：

⑴DNA-polα（引物酶活性）；

⑵DNA-polδ（解螺旋酶活性）；

⑶

拓?fù)涿福?/p>

⑷單鏈DNA結(jié)合蛋白⑸復(fù)制蛋白(replicationproteinA，RPA)。

（二）真核細(xì)胞DNA復(fù)制的過程第54頁(yè)/共118頁(yè)3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體2、復(fù)制的延長(zhǎng)需要：DNApolδ——催化新鏈延長(zhǎng)；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）——

提高DNApolδ在模板上的行進(jìn)能力。第55頁(yè)/共118頁(yè)染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）真核細(xì)胞DNA復(fù)制的終止第56頁(yè)/共118頁(yè)53355335+5333355復(fù)制的終止——第57頁(yè)/共118頁(yè)

端粒(telomere)：指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。

功能?維持染色體的穩(wěn)定性?保證染色體末端DNA復(fù)制的完整性

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是富含T、G短序列的多次重復(fù)。TTTTGGGGTTTTGGGG…1、端粒的復(fù)制：第58頁(yè)/共118頁(yè)

端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成第59頁(yè)/共118頁(yè)端粒酶的催化機(jī)制爬行模型第60頁(yè)/共118頁(yè)DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工第61頁(yè)/共118頁(yè)2、端粒酶與藥物（1）針對(duì)端粒酶RNA或端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的mRNA設(shè)計(jì)反義寡核苷酸藥物———

阻斷端粒DNA的合成或端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。如：肽核酸（PNA）是一種非常有前途的藥物。

肽核酸的用途：抗癌研究——顯著抑制永生化的腫瘤細(xì)胞端粒酶活性；病原體檢測(cè)的分子雜交、原位雜交、突變分析等；基因芯片的制備，是基因芯片的升級(jí)產(chǎn)品；定量PCR，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。第62頁(yè)/共118頁(yè)（2）核酶：直接作用于端粒酶RNA的錘頭狀核酶。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：如：3′-疊氮胸苷（4）其它：核苷類似物、端粒酶蛋白抗體等。（四）真核細(xì)胞端粒復(fù)制過程中的核小體結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制——半保留式復(fù)制；組蛋白合成——也不是全保留的；核小體的重新裝配機(jī)制不十分清楚。第63頁(yè)/共118頁(yè)四、線粒體DNA的復(fù)制（一）線粒體DNA結(jié)構(gòu)閉環(huán)雙鏈DNA，一條重鏈，一條輕鏈。不同生物線粒體基因組大小不同，人16569bp。細(xì)胞器中有多個(gè)類核區(qū)，各含多拷貝的DNA分子。與核DNA相比，mtDNA所占的比例很小，僅為1％。mtDNA結(jié)構(gòu)緊湊，幾乎沒有重復(fù)序列。mtDNA上某些基因可以重疊，但沒有內(nèi)含子。有一個(gè)D環(huán)（非編碼區(qū)），2個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。動(dòng)物細(xì)胞mtDNA編碼2個(gè)rRNA、22個(gè)tRNA和多種酶蛋白，如細(xì)胞色素氧化酶、ATP酶等。第64頁(yè)/共118頁(yè)（二）線粒體DNA的復(fù)制過程D環(huán)復(fù)制（D-loopreplication）方式dNTPDNA-polγ

第65頁(yè)/共118頁(yè)（三）線粒體基因與疾病1、勒伯爾遺傳性視神經(jīng)病2、神經(jīng)源性肌軟弱、共計(jì)失調(diào)伴視網(wǎng)膜色素變性3、阿爾茨海墨病4、氨基苷類抗生素致聾5、帕金森氏病6、糖尿病7、心機(jī)病8、衰老與腫瘤mtDNA幾乎沒有重復(fù)序列；沒有內(nèi)含子；某些區(qū)域基因重疊；沒有蛋白質(zhì)保護(hù)；所以mtDNA基因突變頻率高于核DNA。引發(fā)許多疾病：第66頁(yè)/共118頁(yè)五、噬菌體和病毒DNA的復(fù)制（一）單鏈環(huán)狀DNA病毒的復(fù)制1、第一階段：以親本單鏈（＋）為模板，合成互補(bǔ)鏈（－），形成閉合的雙鏈環(huán)狀復(fù)制形。2、第二階段：滾環(huán)復(fù)制。一個(gè)負(fù)鏈可以合成許多正鏈，正鏈用于噬菌體包裝。3′-OH5′-P3′-OH5′-P第67頁(yè)/共118頁(yè)（二）線狀DNA病毒的復(fù)制1、雙鏈線狀DNA的復(fù)制有兩種起始類型：從DNA分子的中間起始從DNA分子末端起始腺病毒DNA的復(fù)制：從DNA分子末端起始，以單鏈置換形式進(jìn)行。2、雙鏈線狀DNA復(fù)制的終止：形成一個(gè)大分子的串聯(lián)體（多聯(lián)體）。第68頁(yè)/共118頁(yè)圖p116頁(yè)第69頁(yè)/共118頁(yè)3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′第70頁(yè)/共118頁(yè)3、單鏈線狀DNA的復(fù)制：微小病毒的復(fù)制圖p118頁(yè)第71頁(yè)/共118頁(yè)RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA（三）逆轉(zhuǎn)錄病毒1、逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制：

從單鏈RNA到雙鏈DNA的生成分三步第72頁(yè)/共118頁(yè)

逆轉(zhuǎn)錄酶有三種活性：①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；②RNase活性；③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性。第73頁(yè)/共118頁(yè)

逆轉(zhuǎn)錄過程：①逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA與宿主tRNA分子互補(bǔ)形成局部雙鏈，以tRNA為引物，合成DNA負(fù)鏈5′端。②由RNaseH水解去除雜化雙鏈中的RNA5′端。③新合成DNA負(fù)鏈的3′端跳到模板RNA的3′端，并通過兩條鏈上共同的R序列形成雜交鏈。④DNA負(fù)鏈向5′端延伸。⑤RNaseH去除雜化雙鏈中的絕大部分RNA。第74頁(yè)/共118頁(yè)⑦RNaseH去除RNA和tRNA引物。DNA正鏈的3′端跳到DNA負(fù)鏈的3′端，以兩條鏈共有的PBS序列雜交，形成局部雙鏈。⑨雙向延伸完成DNA雙鏈合成。⑥以剩余的一段RNA作引物合成DNA正鏈的3′端。第75頁(yè)/共118頁(yè)第76頁(yè)/共118頁(yè)2、逆轉(zhuǎn)錄病毒與疾?。?/p>

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞后，通過反向轉(zhuǎn)錄整合到宿主基因組中形成相應(yīng)的前病毒，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒及前病毒的基因產(chǎn)物可以致癌。

逆轉(zhuǎn)錄病毒大都是致癌RNA病毒。在人類，逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入會(huì)引起某些腫瘤的發(fā)生。ALV病毒插入到c-myc基因座位后，可以不同的方式激活這個(gè)癌基因，造成c-myc基因的過渡表達(dá)，產(chǎn)生腫瘤。第77頁(yè)/共118頁(yè)第78頁(yè)/共118頁(yè)3、HIV與藥物HIV也是逆轉(zhuǎn)錄病毒，其復(fù)制過程及生活周期類似于RNA腫瘤病毒。HIV一般不會(huì)將宿主細(xì)胞溶解，但HIV是一種慢病毒，可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生病變。

抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性是艾滋病治療的關(guān)鍵：（1）核苷類似物：如疊氮胸苷，3′-疊氮脫氧胸苷。（2）非核苷類似物：特異性增高。（3）HIV-1蛋白酶的抑制劑。第79頁(yè)/共118頁(yè)（一）突變（mutation）的概念：是指DNA堿基序列發(fā)生的可遺傳的任何永久性的改變。第二節(jié)基因突變一、突變概念和類型自發(fā)突變：spontaneousmutation誘發(fā)突變：inducedmutation突變生成作用：mutagenesis突變基因：mutantgene突變體：mutant

相關(guān)概念：第80頁(yè)/共118頁(yè)（二）突變類型（1）點(diǎn)突變（pointmutation）：即堿基錯(cuò)配

點(diǎn)突變的重要特點(diǎn)之一是具有很高的回復(fù)突變率。轉(zhuǎn)換：同型堿基的改變；即嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的變化。顛換：異型堿基的改變；即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的變化。包括1、根據(jù)DNA堿基序列改變進(jìn)行分類：點(diǎn)突變：又分為單點(diǎn)突變和多點(diǎn)突變第81頁(yè)/共118頁(yè)（2）堿基插入（baseinsertion）

是指一個(gè)原來(lái)沒有的堿基或一段原來(lái)沒有的核苷酸插入到DNA大分子中間。（3）堿基缺失（basedeletion）

指一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。

框移突變（frame-shiftmutation）：插入或缺失導(dǎo)致三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出的蛋白質(zhì)可能完全不同。2、對(duì)閱讀框架的影響：第82頁(yè)/共118頁(yè)5′……GCAGUACAUGUC……

丙纈組纈GAGUACAUGUC……

谷酪蛋絲實(shí)線：原來(lái)的密碼讀法虛線：缺失C后的密碼讀法第83頁(yè)/共118頁(yè)⑴同義突變(synonymousmutation)：是指沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子變化，即與密碼子的簡(jiǎn)并性相關(guān)。3、根據(jù)對(duì)遺傳信息的改變情況進(jìn)行分類：⑵錯(cuò)義突變(missensemutation)：

指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的變化。

有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的功能，會(huì)產(chǎn)生致死性突變。有些錯(cuò)義突變基本不影響蛋白質(zhì)功能，稱為中性突變。中性突變與同義突變一起被稱為無(wú)聲突變。第84頁(yè)/共118頁(yè)⑶無(wú)義突變(nonsensemutation)：是指某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榈鞍踪|(zhì)合成的終止密碼子，使肽鏈合成過早終止。因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般沒有活性。4、根據(jù)突變表現(xiàn)型對(duì)外界環(huán)境的敏感性分類：（1）非條件性突變：nonconditionalmutation（2）條件性突變：conditionalmutation

最常見的條件性突變?yōu)闇囟让舾型蛔儭５?5頁(yè)/共118頁(yè)⑵回復(fù)突變（back或reversemutation）：突變體失去的野生型性狀可以通過第二次突變得到恢復(fù)，第二次突變叫回復(fù)突變。5、根據(jù)突變效應(yīng)是否背離野生型進(jìn)行分類：⑴正向突變（forwardmutation）：

指改變了野生型性狀的突變。

回復(fù)突變可以使原來(lái)的突變基因序列回復(fù)正常，這是真正的回復(fù)突變，此情況很少。如：GGA→GUA→GGA第86頁(yè)/共118頁(yè)

抑制突變可以發(fā)生在正向突變的基因之中，叫作基因內(nèi)抑制突變；

大多數(shù)是第二次點(diǎn)突變并沒有改變正向突變的DNA堿基序列，只是其突變效應(yīng)被抑制了，這種第二次回復(fù)突變稱為抑制突變

(suppressormutation)。也可以發(fā)生在其它基因之中，叫作基因間抑制突變。6、根據(jù)影響基因調(diào)控的序列進(jìn)行分類：?jiǎn)?dòng)子上升突變：突變?cè)鰪?qiáng)啟動(dòng)子的活性；啟動(dòng)子下降突變：突變降低啟動(dòng)子的作用。第87頁(yè)/共118頁(yè)HbAβ基因HbSβ基因CTCCACGAGGTG

鐮形紅細(xì)胞貧血病人的Hb為HbS

正常成人Hb為HbAHbS=α2β26glu→valHbAβ肽鏈

N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu······C(146)HbSβ肽鏈

N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu······C(146)第88頁(yè)/共118頁(yè)二、突變?cè)颍ㄒ唬┳园l(fā)突變（spontaneousmutation）1、DNA的復(fù)制錯(cuò)誤：復(fù)制錯(cuò)誤引起損傷，在DNA損傷中最為多見。2、由于堿基本身存在互變異構(gòu)體，可能形成錯(cuò)誤的堿基配對(duì)。

復(fù)制錯(cuò)誤最多見于尿嘧啶（U）的滲入，另外偶有其它堿基的滲入。第89頁(yè)/共118頁(yè)3、堿基自發(fā)的化學(xué)變化：（1）脫嘌呤或脫嘧啶作用：是指DNA分子上丟掉了嘌呤堿或嘧啶堿，形成無(wú)堿基位點(diǎn)，稱為AP部位

(apyrimidine，apurinesite,AP)。在生理狀態(tài)下，脫嘌呤是脫嘧啶的20倍。（2）脫氨基作用：即胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤的環(huán)外氨基自發(fā)丟失。

胞嘧啶→尿嘧啶；腺嘌呤→次黃嘌呤；鳥嘌呤→黃嘌呤。脫氨基所至的堿基轉(zhuǎn)變可影響DNA的復(fù)制，由此產(chǎn)生突變。4、氧化作用損傷堿基：第90頁(yè)/共118頁(yè)1、物理因素：

包括紫外線(UV)、x射線、γ射線等各種輻射。

UV（二）誘發(fā)突變（inducedmutation）

第91頁(yè)/共118頁(yè)2、化學(xué)誘變劑：第92頁(yè)/共118頁(yè)（三）基因的人工誘變1、體外定向突變的原理：

此技術(shù)由加拿大學(xué)者M(jìn)ichaelSmith于1985年建立。主要由于基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究。（1）體外定向突變的方法：①聚核苷酸介導(dǎo)的單鏈模板定點(diǎn)突變；②雙引物法定點(diǎn)突變；③用摻入U(xiǎn)的單鏈為模板進(jìn)行聚核苷酸介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變。第93頁(yè)/共118頁(yè)（2）聚核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?cè)恚孩傧群铣梢粭l包括定點(diǎn)突變堿基及附近序列的一段寡核苷酸。②將待研究的DNA克隆變性后插入到M13中。③將合成的寡核苷酸與M13中的DNA克隆進(jìn)行分子雜交。④以寡核苷酸為引物，M13中的DNA克隆的互補(bǔ)單鏈為模板，合成完整的互補(bǔ)鏈。⑤將此雙鏈DNA導(dǎo)入大腸桿菌中，經(jīng)修復(fù)和DNA復(fù)制即可得到穩(wěn)定遺傳的突變DNA克隆。

獲得的突變體DNA再送回細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)突變效應(yīng)：等位基因代換法；重組DNA技術(shù)；DNA同源重組。第94頁(yè)/共118頁(yè)2、體外定向突變的應(yīng)用：（1）將胰高血糖素21位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，研究胰高血糖素結(jié)構(gòu)與功能的變化。（2）研究組蛋白脫乙?；副Ｊ匕被嶂薪M氨酸的定點(diǎn)突變對(duì)其功能的影響。（3）通過人血紅蛋白α99、β82位點(diǎn)突變，研究血紅蛋白四聚體的穩(wěn)定性。（四）適應(yīng)性突變

不能利用乳糖的LacZ－菌株，放在以乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便突變產(chǎn)生可以利用乳糖的LacZ＋菌株，此為適應(yīng)性突變。第95頁(yè)/共118頁(yè)

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，生物體演化出了一整套十分有效的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，包括：①糾正偶然復(fù)制錯(cuò)誤的系統(tǒng)——復(fù)制修復(fù)

DNA聚合酶的3′→5′校讀功能

DNA糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)等第三節(jié)DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng)③復(fù)制后修復(fù)：主要包括重組修復(fù)系統(tǒng)、SOS修復(fù)系統(tǒng)。②修復(fù)環(huán)境因素致DNA損傷的系統(tǒng)——損傷修復(fù)主要包括：光修復(fù)系統(tǒng)、切除修復(fù)系統(tǒng)第96頁(yè)/共118頁(yè)1、尿嘧啶糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)：

對(duì)于糾正復(fù)制錯(cuò)誤尤為重要。ATCGAGTTAGCUCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCTCA尿嘧啶糖苷酶UAP內(nèi)切酶連接酶外切酶修復(fù)聚合酶dUTP滲入胞嘧啶脫氨一、復(fù)制修復(fù)第97頁(yè)/共118頁(yè)2、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：原核和真核生物DNA在復(fù)制過程中均可產(chǎn)生堿基錯(cuò)配DNA聚合酶3′→5′校讀功能立即糾正錯(cuò)誤(10－8)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)第二次糾正錯(cuò)誤(10－10～10－11)保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。第98頁(yè)/共118頁(yè)DNA復(fù)制的保真性：①遵循堿基配對(duì)規(guī)律②DNApolⅢ對(duì)堿基的的嚴(yán)格選擇功能③DNApolⅠ的3′→5′即時(shí)校讀功能④錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)第二次糾正錯(cuò)誤⑤DNA糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)第99頁(yè)/共118頁(yè)

大腸桿菌錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)參與因素：①三種錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)產(chǎn)物－MutS、MutL

和MutH啟動(dòng)該系統(tǒng)。②GATC內(nèi)切核酸酶（錯(cuò)配矯正酶）與MutH蛋白一起切開單鏈。③DNA解螺旋酶Ⅱ解螺旋。④雙向外切核酸酶依次切除錯(cuò)配的核苷酸。⑤DNApolⅠ填補(bǔ)空隙。⑥D(zhuǎn)NA連接酶完成修復(fù)。（1）錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)作用機(jī)制第100頁(yè)/共118頁(yè)

錯(cuò)配修復(fù)過程：MutS識(shí)別結(jié)合到錯(cuò)配部位，形成MutS-DNA錯(cuò)配復(fù)合物啟動(dòng)MutL與錯(cuò)配復(fù)合物結(jié)合，激活GATC核酸內(nèi)切酶和MutH蛋白二者對(duì)含有錯(cuò)配堿基和GATC序列的單鏈進(jìn)行內(nèi)切DNA解螺旋酶Ⅱ(MutH蛋白)解螺旋雙向性外切核酸酶依次切除錯(cuò)配的核苷酸DNApolⅠ以甲基化的親代母鏈為模板填補(bǔ)空隙DNA連接酶連接切口完成修復(fù)第101頁(yè)/共118頁(yè)CH3CH35′3′CH3CH35′3′MutLMutSMutHCH3CH35′3′

解螺旋酶外切核酸酶CH3CH35′3′DNApolⅠDNA連接酶第102頁(yè)/共118頁(yè)

如何識(shí)別復(fù)制后堿基錯(cuò)配的子鏈呢？①正常情況下，天然DNA復(fù)制后腺嘌呤的N6位都進(jìn)行甲基化。②腺嘌呤的甲基化是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。這一標(biāo)志具有堿基序列的特異性，即N6-甲基腺嘌呤都存在于GATC序列中。③新合成子鏈在其合成后瞬間GATC序列中的腺嘌呤未被甲基化，修復(fù)系統(tǒng)就能區(qū)分甲基化的母鏈與未被甲基化的子鏈。第103頁(yè)/共118頁(yè)

真核細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：

錯(cuò)配修復(fù)基因已從酵母和人類克隆出來(lái)，其產(chǎn)物功能與大腸桿菌相似，都具有鏈特異性，但修復(fù)能力強(qiáng)于大腸桿菌。大腸桿菌只能修復(fù)3個(gè)或3個(gè)以下的錯(cuò)配核苷酸，而人類則可修復(fù)5個(gè)或5個(gè)以上的錯(cuò)配袢。細(xì)菌酵母人類mutSMSH2hMSH2mutLMLH1hMLH1

PMS1hPMS1hPMS2mutH??錯(cuò)配修復(fù)基因第104頁(yè)/共118頁(yè)（2）錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷與人類疾?。?/p>

人類四種錯(cuò)配修復(fù)基因中任何一種基因發(fā)生突變均可產(chǎn)生錯(cuò)配修復(fù)缺陷，這是遺傳性非息肉型結(jié)腸癌（HNPCC）發(fā)病的病因。錯(cuò)配修復(fù)缺失促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎患者的癌變轉(zhuǎn)化過程。第105頁(yè)/共118頁(yè)3、無(wú)嘌呤（AP）修復(fù)：

堿基丟失可產(chǎn)生AP位點(diǎn)：一方面利用AP內(nèi)切酶、5′→3′外切酶、聚合酶和連接酶的修復(fù)作用；另一方面直接利用插入酶補(bǔ)回正確的堿基。關(guān)于堿基插入酶的生物學(xué)意義不十分清楚，它可能為修復(fù)AP位點(diǎn)提供了一條更為迅捷的途徑，當(dāng)AP內(nèi)切酶基因突變時(shí)，這一途徑更為重要。第106頁(yè)/共118頁(yè)1、光修復(fù)光修復(fù)酶(photolyase)

UV二、損傷修復(fù)第107頁(yè)/共118頁(yè)2、甲基轉(zhuǎn)移酶：

在烷化劑作用下，鳥嘌呤的6位可被甲基化生成O6-甲基鳥嘌呤。

O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶能去除O6上的甲基，恢復(fù)正常的鳥嘌呤。3、切除修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。第108頁(yè)/共118頁(yè)UvrAUvrA2UvrA2UvrB2UvrA2UvrB2－DNAUvrA2UvrC進(jìn)入U(xiǎn)vrB2UvrC2－DNAUvrB在損傷部位3′端切口UvrC在損傷部位5′端切口(此雙切不同步，3′在5′后)UvrD解旋釋出損傷片段UvrCDNApolⅠ填充空隙連接酶完成修復(fù)(Leu拉鏈)E.coli的切除修復(fù)機(jī)制第109頁(yè)/共118頁(yè)E.coli的切除修復(fù)方式DNApolⅠ,dNTPOHPDNAligaseATPADPUvrAUvrBUvrCUvrBUvrD第110頁(yè)/共118頁(yè)1、重組修復(fù)三、復(fù)制后修復(fù)

這種修復(fù)是指DNA分子損傷范圍較大，來(lái)不及修復(fù)就進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制后再進(jìn)行切除修復(fù)，故稱復(fù)制后修復(fù)。第111頁(yè)/共118頁(yè)3′5′5′復(fù)制3′5′3′5′3′5′3′5′3′誘導(dǎo)激活RecA蛋白■5′3′■5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′損傷的DNA分子切除修復(fù)DNApolⅠDNA連接酶RecA蛋白脫落

大腸桿菌重組修復(fù)機(jī)制：第112頁(yè)/共118頁(yè)2、SOS修復(fù)當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。故稱錯(cuò)誤傾向修復(fù)。第113頁(yè)/共118頁(yè)四、限制與修飾

細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)由甲基化酶和限制性核酸內(nèi)切酶組成，防止外來(lái)DNA的入侵。即：限制性核酸內(nèi)切酶只能切斷外來(lái)DNA，不能切割自身，因自身DNA有甲基化的修飾。

核苷酸切除修復(fù)所需基因中任何一種基因突變，皆可引起著色性干皮病，患者皮膚癌的危險(xiǎn)性比正常人高1000～2000倍。五、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)與疾病第114頁(yè)/共118頁(yè)復(fù)習(xí)思考題1、解釋概念：Klenow片段、缺口平移、崗崎片段2、試述解旋酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、原核生物DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ、Klenow片段、真核生物DNA聚合酶的作用特點(diǎn)。3、參與DNA復(fù)制的主要物質(zhì)有哪些？

DNA聚合反應(yīng)的特點(diǎn)如何？4、原核生物DNA復(fù)制起始所參與的因素有哪些？作用如何？5、何謂端粒、端粒酶？端粒的結(jié)構(gòu)與功能如何？試分析端粒和端粒酶與衰老和腫瘤的關(guān)系怎樣通過抑制端粒酶活性來(lái)開發(fā)抗腫瘤藥物？第115頁(yè)/共118頁(yè)6、逆轉(zhuǎn)錄酶有哪三種活性？試述逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA

的復(fù)制過程，并解釋其致癌機(jī)制。7、解釋概念：突變、點(diǎn)突變、框移突變、同義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、正向突變、回復(fù)突變、抑制突變、啟動(dòng)子上升突變、啟動(dòng)子下降突變8、簡(jiǎn)述尿嘧啶糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)的過程。9、試比較復(fù)制修復(fù)、損傷修復(fù)、復(fù)制后修復(fù)的不同點(diǎn)。第116頁(yè)/共118頁(yè)dPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYqx-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#