生物分離工程生物大分子的初級分離技術(shù)

生物分離工程生物大分子的初級分離技術(shù)第1頁/共46頁總體學(xué)習(xí)目的和要求

了解蛋白質(zhì)表面特性，掌握各種沉淀和泡沫分離的原理、特點(diǎn)以及應(yīng)用范圍。

第2頁/共46頁目錄引言沉淀分離蛋白質(zhì)表面特性鹽析沉淀等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀熱沉淀其他沉淀法沉淀生成動力學(xué)泡沫分離第3頁/共46頁一、引言－學(xué)習(xí)要點(diǎn)識記：初級分離概念理解：初級分離特點(diǎn)第4頁/共46頁初級分離概念初級分離是指從發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液、胞內(nèi)抽提液（細(xì)胞破碎液）及其他各種生物原料初步提取目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到濃縮和初步分離的下游加工過程。第5頁/共46頁初級分離特點(diǎn)分離對象：體積大、雜質(zhì)含量高；分離技術(shù)：低操作成本、適于大規(guī)模生產(chǎn)第6頁/共46頁二、沉淀分離－學(xué)習(xí)要點(diǎn)識記：鹽析和鹽溶概念理解：蛋白質(zhì)凝集沉淀的屏障，各種沉淀方法的原理和影響因素應(yīng)用：采用不同的試劑方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀第7頁/共46頁沉淀的定義由于物理環(huán)境的變化而引起溶質(zhì)溶解度的降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象，稱為沉淀。

第8頁/共46頁沉淀與結(jié)晶的區(qū)別沉淀生成的固體顆粒是不定形的結(jié)晶產(chǎn)品為單一組分，而沉淀凝聚物則成分非常復(fù)雜（除了目標(biāo)產(chǎn)物外，還夾雜著多種共存的雜質(zhì)、鹽和溶劑等）沉淀的純度遠(yuǎn)低于結(jié)晶多步沉淀操作也可獲得高純度的目標(biāo)產(chǎn)品第9頁/共46頁沉淀技術(shù)適用范圍

沉淀分離在生物分離過程中應(yīng)用相當(dāng)廣泛。一般情況下，沉淀分離方法在生物下游加工過程中通常作為初級分離技術(shù)加以使用，但在實(shí)際過程中也有僅通過沉淀分離得到目標(biāo)產(chǎn)品的工業(yè)實(shí)例。第10頁/共46頁蛋白質(zhì)表面特性－蛋白質(zhì)組成蛋白質(zhì)組成20種氨基酸構(gòu)成的兩性高分子電解質(zhì)，包括疏水性氨基酸和親水性氨基酸蛋白質(zhì)折疊趨勢疏水性氨基酸：向內(nèi)部折疊的趨勢親水性氨基酸：分布于蛋白質(zhì)外表面的趨勢

結(jié)果

在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中仍會有部分疏水性氨基酸殘基暴露于表面，在蛋白質(zhì)表面形成一定的疏水區(qū)

第11頁/共46頁膠體的定義膠體是一種尺寸在1～100nm以至1000nm的分散體。它既非大塊固體，又不是分子分散的液體，而是具有兩相的微不均勻分散體系。

-《被遺忘了尺寸的世界》WilhelmFriedrichOstwald(1853–1932)第12頁/共46頁膠體的性質(zhì)比表面增大，界面現(xiàn)象重要

強(qiáng)烈的尺寸效應(yīng)第13頁/共46頁蛋白質(zhì)表面特性－蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量約6～1000kDa，分子直徑約為1~30nm。在此粒徑范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)可視為膠體，并表現(xiàn)出膠體溶液的部分性質(zhì)蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)兩端及側(cè)鏈中有一些解離基，解離程度受pH影響。蛋白質(zhì)的變性

物理因素：加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學(xué)因素：有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、SDS等。

第14頁/共46頁蛋白質(zhì)表面特性－沉淀屏障蛋白質(zhì)分子周圍的水化層水溶液中蛋白質(zhì)可視為膠粒，其周圍存在著穩(wěn)定的水化層膠粒外的這部分水客觀上起排斥作用，稱為“水化層斥力”分子間的靜電排斥作用根據(jù)擴(kuò)散雙電層理論，膠粒是帶電的，其表面吸附相反電荷的反離子，這些位于膠粒周圍過量的反離子好像膠粒四周為離子氛所包圍。當(dāng)兩個膠粒（蛋白質(zhì)）趨近而使離子氛發(fā)生重疊時，處于重疊區(qū)內(nèi)的反離子濃度較大，從而破壞了原有電荷的對稱性，引起離子氛中電荷重新分布，即離子從濃度較大的重疊區(qū)向未重疊區(qū)擴(kuò)散。這種擴(kuò)散的結(jié)果就是膠粒受到斥力而相互脫離。第15頁/共46頁蛋白質(zhì)表面特性

－沉淀策略及方法策略破壞蛋白質(zhì)四周水化層降低雙電層厚度沉淀方法

改變?nèi)芤簆H值

加入無機(jī)鹽或改變無機(jī)鹽種類加入水溶性有機(jī)溶劑添加脫水劑第16頁/共46頁蛋白質(zhì)表面特性

－常用的沉淀技術(shù)鹽析沉淀等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀聚合物沉淀熱沉淀第17頁/共46頁鹽析沉淀-學(xué)習(xí)要點(diǎn)識記：鹽析和鹽溶概念

理解：鹽析沉淀的原理，影響鹽析的各種因素

應(yīng)用：掌握鹽析操作過程

第18頁/共46頁鹽析沉淀-鹽析的定義定義

蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析（Salting-out）溶解度與I的關(guān)系－Cohn方程

第19頁/共46頁鹽析沉淀-鹽析原理低離子強(qiáng)度下的鹽溶

向蛋白質(zhì)的純水溶液中加入電介質(zhì)后，蛋白質(zhì)將吸附鹽離子，而形成擴(kuò)散雙電層（產(chǎn)生分子間相互排斥作用）導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增大，發(fā)生鹽溶高離子強(qiáng)度下的鹽析溶液主體中那些與擴(kuò)散層反離子電荷符號相同的電解質(zhì)離子將把反離子壓入（排斥）到雙電層中由于鹽的水化作用，其將爭奪蛋白質(zhì)水化層中的水分子，使蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)脫水而暴露，增大它們之間的疏水性作用第20頁/共46頁鹽析沉淀-鹽析原理圖示第21頁/共46頁鹽析沉淀-影響鹽析因素蛋白質(zhì)的分子量和結(jié)構(gòu)

無機(jī)鹽種類和濃度

相同離子強(qiáng)度下，不同種類的鹽對蛋白質(zhì)的鹽析效果不同鹽的種類將影響到Cohn方程中的鹽析常數(shù)鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響與離子的感膠離子序列相符溫度和pH值

在低離子強(qiáng)度溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度在一定的溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高而增大在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度的升高利于蛋白質(zhì)脫水，破壞水化層并導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度的降低

第22頁/共46頁鹽析沉淀-無機(jī)鹽的選擇溶解度大可配制成具有較高離子強(qiáng)度的無機(jī)鹽溶液溶解度受溫度的影響較小鹽溶液密度不高，以便蛋白質(zhì)沉淀的沉降或離心分離。第23頁/共46頁鹽析操作-沉淀劑性質(zhì)

對于用于沉淀劑的無機(jī)鹽試劑，了解其性質(zhì)，特別是無機(jī)鹽的溶解性質(zhì)（溶液密度、飽和濃度等），是必需的。以硫酸銨為例：20℃下，飽和濃度為4.05mol/L（相當(dāng)于534g/L）飽和密度為1.235kg/L；0℃下，飽和濃度為3.825mol/L（相當(dāng)于505g/L）

第24頁/共46頁鹽析操作-溶解度曲線確定離心分離沉淀物并重新溶解測定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白的濃度以飽和度為橫坐標(biāo)，上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線第25頁/共46頁Typicalammoniumsulphateprecipitationrangesforproteinsfromacrudeextractinsupernatant.(●)EGFPrelativecontentinsupernatant,(■)totalproteinrelativecontentinsupernatant

第26頁/共46頁NormalizedeGFPcontentintheprecipitatedpelletatdifferentsaturationofammoniumsulfate第27頁/共46頁鹽析操作-無機(jī)鹽加入量硫酸銨的摩爾濃度由M1增大到M2所需要加入的硫酸銨質(zhì)量W為

20℃0℃如果用飽和度S代替摩爾濃度M，第28頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀-學(xué)習(xí)要點(diǎn)理解：等電點(diǎn)沉淀法原理應(yīng)用：了解等電點(diǎn)沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍第29頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀-定義利用蛋白質(zhì)在pH值等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下降的原理進(jìn)行沉淀分級的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法

第30頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀原理利用在低離子強(qiáng)度下蛋白質(zhì)溶解度較低的特性，調(diào)整溶液pH值至等電點(diǎn)或在等電點(diǎn)的pH下利用透析等方法降低離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)沉淀。第31頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀-沉淀?xiàng)l件較低的溶液離子強(qiáng)度溶液的pH值接近等電點(diǎn)第32頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀-實(shí)現(xiàn)方式在低離子強(qiáng)度下調(diào)整溶液pH值至等電點(diǎn)在等電點(diǎn)的pH值下利用透析等方法降低溶液的離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)沉淀

第33頁/共46頁等電點(diǎn)沉淀-操作特點(diǎn)等電點(diǎn)沉淀在較低的離子強(qiáng)度下進(jìn)行，因此沉淀操作結(jié)束后無需脫鹽

與其它沉淀結(jié)合使用，例如在等電點(diǎn)附近進(jìn)行的鹽析沉淀操作時可以獲得更小的蛋白質(zhì)溶解度

溶液的pH值調(diào)節(jié)方便，但過低的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)容易引起目標(biāo)蛋白質(zhì)變性第34頁/共46頁有機(jī)溶劑沉淀-學(xué)習(xí)要點(diǎn)理解：有機(jī)溶劑沉淀法原理應(yīng)用：了解有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍第35頁/共46頁有機(jī)溶劑沉淀-原理向蛋白質(zhì)溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑：水的活度將降低有機(jī)溶劑對水具有很大的親和力，能夠爭奪蛋白質(zhì)表面的水分子。結(jié)果：隨有機(jī)溶劑濃度增大，水化程度降低，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而發(fā)生凝聚和沉淀

第36頁/共46頁有機(jī)溶劑沉淀-原理圖示第37頁/共46頁有機(jī)溶劑沉淀-特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)有機(jī)溶劑密度較低，易于沉淀分離與鹽析沉淀相比，沉淀產(chǎn)物不需脫鹽缺點(diǎn)有機(jī)溶劑沉淀容易引起蛋白質(zhì)變性第38頁/共46頁熱沉淀-學(xué)習(xí)要點(diǎn)理解：了解熱沉淀原理

第39頁/共46頁熱沉淀-原理在較高的溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性，有規(guī)則的肽鏈結(jié)構(gòu)被打開呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而發(fā)生凝聚和沉淀，利用這一現(xiàn)象，可根據(jù)蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的熱沉淀，以分離出熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)蛋白產(chǎn)物

與前面介紹的熱力學(xué)沉淀方法不同，熱沉淀過程是基于蛋白質(zhì)的變性動力學(xué)第40頁/共46頁其他沉淀技術(shù)聚合物沉淀

非離子型聚合物沉淀聚電解質(zhì)沉淀

重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)

生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)

第41頁/共46頁沉淀生成動力學(xué)-沉淀生長

異向生長

發(fā)生在沉淀生成初期，微細(xì)的蛋白質(zhì)顆粒為布朗粒子，沉淀生長為擴(kuò)