蛋白質(zhì)理化性能與純化課件

第六節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein一、理化性質(zhì)

（一）蛋白質(zhì)的兩性電離性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。*蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（三）很多因素可引起蛋白質(zhì)的變性*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)：在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失；*變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白；

造成變性的因素溫度（熱、冷）加熱；強酸、強堿；尿素和鹽酸胍的影響（破壞分子內(nèi)部氫鍵、破壞疏水效應）；表面活性劑的影響：如十二烷基硫酸鈉（SDS）等變性的本質(zhì)——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。食品方面；蛋白質(zhì)制備；酶制劑保存等；此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

應用舉例尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇

天然狀態(tài)，有催化活性非折疊狀態(tài)，無活性（四）蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)沉淀

在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而蛋白質(zhì)從溶液中析出；變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性；蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中；蛋白質(zhì)的沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀。鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉）使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象（水與離子的相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的疏水補丁的相互作用；同時瓦解了以電荷為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分子之間的作用）。鹽溶：低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，此現(xiàn)象叫鹽溶。等電點沉淀法（脫去水化層、降低介電常數(shù)）。在低溫下或縮短處理時間可防止或減緩變性。有機溶劑沉淀法2、不可逆沉淀在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。（五）蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強的吸收；蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定和定量測定。二、蛋白質(zhì)的分離和純化

純化的目標

盡量提高蛋白質(zhì)的純度或比活性，設法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般原則

1）從組織細胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用低溫冰凍、化學試劑及溶菌酶破壁、破膜，再用溶劑提取。

2）分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)a等電點沉淀b鹽析和有機溶劑分級分離

1、天然蛋白質(zhì)的分離（二）透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。透析的示意圖（三）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。（四）利用荷電性質(zhì)可將蛋白質(zhì)采用電泳法進行分離蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)

。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS),常用于蛋白質(zhì)分子量的測定;*等電聚焦電泳(isoelectricequilibriumelectrophoresis,IEE)，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法;*雙向凝膠電泳(two-dimentionalgelelectrophoresis,2-DGE)是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳MSDS-15%PAGE大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的電泳（五）應用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進行層析分離層析或色譜(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。離子交換色譜（ionexchangechromatography,IEC)；凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析(molecularsievefiltration)或體積排阻色譜（stericexclusionchromatography）；疏水相互作用色譜（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）；親和色譜（AffinityChromatography，AFC)。蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法IEC是利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離

凝膠過濾或體積排阻色譜（

SEC）或分子篩層析(molecularsievefiltration)是利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離；HIC是基于用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動相分離；AFC是基于固定相的配基與生物大分子之間的特殊的生物親和能力的不同來進行生物大分子相互間的分離。常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。（六）利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離*超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示，沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。離心機和離心沉降法分離蛋白質(zhì)分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。（七）用化學或反向遺傳學方法可分析多肽鏈中氨基酸序列通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定DNA序列排列出mRNA序列氨基酸和肽末端測定法離子交換色譜分析蛋白質(zhì)的

氨基酸組分（八）應用物理學、生物信息學原理可進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定或預測1.二級結(jié)構(gòu)測定

通常采用圓二色譜（circulardichroism,CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。a-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而b-折疊的CD譜不很固定。2.三維空間結(jié)構(gòu)測定X射線衍射法（X-raydiffraction)；核磁共振技術(shù)（nuclearmagneticresonance,NMR)這兩種方法是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準確的方法。3.根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預測

其三維空間結(jié)構(gòu)用分子力學、分子動力學的方法，根據(jù)物理化學的基本原理，從理論上計算蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)；通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行分析，找出一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預測。三、蛋白質(zhì)的分析測定

1凱氏定氮法：

a19世紀丹麥化學家凱道爾所創(chuàng)造的方法，之后又出現(xiàn)了一系列的改良凱氏法;b將樣品蛋白質(zhì)的N經(jīng)消化全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮，測定N的含量，得到蛋白質(zhì)的含量。2雙縮脲法在強堿性溶液中，蛋白質(zhì)與CuSO4反應，生成紫紅色化合物是，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量和AA組成無關(guān)。(一）含量的測定3福林—酚試劑法

a福林—酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑;b堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應;c反應后的蛋白質(zhì)的酚基在堿性條件將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍色的鉬藍和鎢藍，藍色的深淺與蛋白含量質(zhì)成正比。4紫外線吸收法

蛋白質(zhì)中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸收，且在各種蛋白質(zhì)中Tyr、Try含量差別不大，280nm吸收值與濃度具正相關(guān)。

1、

常用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法;2、

高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶;低純度：電泳得到幾條區(qū)帶;（二）蛋白質(zhì)純度的鑒定

1、

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量a電泳中加入SDS（十二烷基硫酸鈉，其帶的負電荷量大大超過蛋白質(zhì)分子電荷量），蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。b在實際測定中用己知相對分子質(zhì)量的單體蛋白質(zhì)作