生物技術與食品安全和品質(zhì)控制

生物技術與食品安全和品質(zhì)控制第1頁/共134頁第一節(jié)生物傳感器及其在食品檢測分析中的應用

由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。（一）生物傳感器的基本組成和分類

1.生物傳感器的基本組成生物識別元件：生物傳感器中固定化的酶、微生物細胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識別能力的生物敏感材料。換能器：能將在生物敏感材料上進行的生化反應產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號的裝置。信號處理裝置：負責信號的分析處理和放大輸出。一、生物傳感器的基本概念第2頁/共134頁2.生物傳感器的分類根據(jù)生物敏感材料可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、組織傳感器和DNA傳感器。根據(jù)換能器的不同，可分為電化學傳感器、介體生物傳感器、測光型生物傳感器、測熱型生物傳感器等。具體到某一種傳感器的命名，一般是采用“功能+結(jié)構特征”的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纖傳感器等。

第3頁/共134頁（二）生物傳感器的工作原理

通過生物的分子識別作用，生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測物質(zhì)特異性結(jié)合，并進行生物化學反應，產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號，信號的大小在一定條件下和樣品中被測物質(zhì)的量存在一定的關系，這些信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號，電信號再經(jīng)信號分析處理系統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測物質(zhì)的量。第4頁/共134頁轉(zhuǎn)換器敏感元件待測物生物傳感器的模型第5頁/共134頁第6頁/共134頁

1.分子識別（molecularrecognition）生物傳感器中的分子識別:指生物敏感材料中生物分子能選擇性地和待測樣品中的待測成分進行特異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。生物敏感材料包括酶、抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細胞和DNA等。酶的分子識別:指酶分子只能和特定的底物分子進行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子的識別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了以酶為生物敏感材料的生物傳感器的分子識別能力。免疫傳感器的分子識別：由傳感器上的生物敏感材料－抗原或抗體物質(zhì)的分子識別能力決定，抗原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）結(jié)合。

DNA傳感器的分子識別：由DNA分子中堿基對的互補結(jié)合特性決定。第7頁/共134頁2.生化反應中量的變化和信號的轉(zhuǎn)換（1）熱焓的變化及其轉(zhuǎn)換（2）光效應及其轉(zhuǎn)換（3）顏色的變化及其轉(zhuǎn)化（4）阻抗的變化及其轉(zhuǎn)換（5）生化反應中其他量的變化及其轉(zhuǎn)化（6）直接產(chǎn)生電信號

第8頁/共134頁將化學變化轉(zhuǎn)變成電信號

酶傳感器為例,酶催化特定底物發(fā)生反應,從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化酶耦合,即組成酶傳感器.常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。第9頁/共134頁將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號

固定化的生物材料與相應的被測物作用時常伴有熱的變化.例如大多數(shù)酶反應的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應的熱效應借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。第10頁/共134頁將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?/p>

過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如設法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測定裝置相連,即可測定過氧化氫含量。還有很多細菌能與特定底物發(fā)生反應,產(chǎn)生熒光.也可以用這種方法測定底物濃度。第11頁/共134頁上述三原理的生物傳感器共同點：都是將分子識別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測物發(fā)生化學反應,將反應后所產(chǎn)生的化學或物理變化再通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行測量,這種方式統(tǒng)稱為間接測量方式.第12頁/共134頁直接產(chǎn)生電信號方式這種方式可以使酶反應伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生.根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。第13頁/共134頁3.生物放大（biologicalamplification）（1）酶催化放大酶是高效專一的催化劑，它可以在很短的時間內(nèi)催化大量底物的轉(zhuǎn)化，通過測定酶所催化反應中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量可以推測（判斷）反應中比底物減少量或產(chǎn)物增加量少得多的酶量，或與酶相關聯(lián)的其他物質(zhì)的量，從而實現(xiàn)生物放大作用。應用這一放大原理可以使檢測方法的靈敏度（最小檢出量）比常規(guī)檢測方法提高2個數(shù)量級。第14頁/共134頁

（2）底物循環(huán)放大被測物S1或S2，在酶E1和酶E2之間不斷循環(huán)，每循環(huán)一次，E1和E2都要分別消耗各自的底物C1和C2，產(chǎn)生對應的產(chǎn)物P1和P2，而循環(huán)過程中被測物S1和S2的濃度保持不變，通過分析C1和C2的消耗量或P1和P2的增加量就可以測定待測物S1或S2的量，實現(xiàn)放大效應。循環(huán)的次數(shù)越多酶消耗的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，放大效率也越高（圖）。

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（3）酶級聯(lián)放大生物體內(nèi)的有些酶（通常為酶原）本身是沒有活性，在輔酶、另外一種酶或酶的變構效應物等激活劑的作用下，酶E1i被激活為酶E1a，E1a激活E2i成E2a，E2a又激活E3i或E3a，由于酶是催化劑可以連續(xù)使用，這樣經(jīng)過一系列的反應，一個分子的輔酶或變構效應物等激活劑就能夠產(chǎn)生成千上萬分子的E3a，然后E3a催化底物S3產(chǎn)生產(chǎn)物P3，通過測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量就可以靈敏地測定輔酶或變構效應物等激活劑的量（圖）。優(yōu)點：效率極高，對提高生物傳感器的靈敏度極為有效。缺點：在生物傳感器中的應用條件較為苛刻。

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（4）脂質(zhì)體技術脂質(zhì)體：由類似于細胞膜的脂質(zhì)膜構成的微球體，在微球體的內(nèi)部包含有被酶、熒光素或電活性物質(zhì)標記的抗原或抗體等標志物，微球體的外膜上結(jié)合有抗原（抗體），當外膜上的抗原（抗體）與待測的抗體（抗原）發(fā)生反應，并和補體結(jié)合時（或在表面活性劑的作用下），微球體破裂，微球體內(nèi)的標志物被釋放。標志物的量大且容易測定，通過測定標志物的釋放量就可以測定出待測抗體（抗原）的量，從而實現(xiàn)生物放大（圖）。缺點：目前還存在著微球體內(nèi)的標志物容易滲漏和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差等不足之處。

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（四）生物傳感器的特點

(1)根據(jù)生物反應的特異性和多樣性,理論上可以制成測定所有生物物質(zhì)的傳感器,因而測定范圍廣泛。(2)一般不需進行樣品的預處理,它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測組分的分離和檢測統(tǒng)一為一體，測定時一般不需另加其他試劑,使測定過程簡便迅速,容易實現(xiàn)自動分析。(3)體積小、響應快、樣品用量少,可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測。第18頁/共134頁(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反復多次使用(5)準確度高,一般相對誤差可達到1%以內(nèi)(6)可進行活體分析(7)傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀,因而便于推廣普及(8)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復雜的物理化學傳感器綜合作用才能獲得的信息。第19頁/共134頁二、生物傳感器中生物敏感材料的固定化

和成膜技術（一）生物材料的固定化技術

指通過物理或化學的方法將酶、微生物細胞和抗原抗體等生物材料限制在一定的區(qū)間內(nèi)，使生物材料只能在特定的區(qū)間進行生化反應，而反應的底物和產(chǎn)物可以自由擴散的技術。生物材料常用的固定化方法包括：夾心法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合法和微膠囊法等（圖）。

第20頁/共134頁（二）成膜技術

1.半導體生物傳感器中的成膜技術（1）紫外線照射法（2）光平板印刷法（3）噴射法

2.L-B膜技術

第21頁/共134頁三、生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應用

（一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析

1.農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測目前有機磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、乙基馬拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測都有相應的研究報道。

1996年余孝穎等采用離子敏場效應管為基礎傳感器（換能器），將乙酰膽堿酯酶通過戊二醛共價交聯(lián)固定于場效應管上，制備得到了乙酰膽堿酯酶場效應管傳感器，用于分析敵敵畏等有機磷農(nóng)藥的殘留。

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原理：乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，當存在有機磷農(nóng)藥殘留時，它們能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，從而使底物的分解減少，膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，其中乙酸的減少量可以通過離子場效應管來測定，且在一定條件下，乙酸的減少量和有機磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關系，因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計算出有機磷農(nóng)藥的殘留。

第23頁/共134頁第24頁/共134頁2.抗生素殘留的分析

青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘留會污染動物性食品，從而對人類的健康造成危害。

Sternesioes等人采用免疫傳感器測定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達到1ng／g，傳感器表面經(jīng)NaOH和HCl處理后可以重復使用。

Avon等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度分析法檢測了牛奶中青霉素的含量。

第25頁/共134頁（二）食品添加劑的分析

亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，美國FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過1×10-6mol／L。

天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。

煙堿酸屬于B族維生素，可以作為肉類食品的發(fā)色劑，但是人體攝入過量的煙堿酸會引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，在日本已禁止使用。其他食品添加劑，如防腐劑苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、過氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸等都可以用相應的生物傳感器來檢測它們在食品中的含量。

第26頁/共134頁第27頁/共134頁（三）污染微生物的檢測

污染食品的微生物可以分為腐敗菌和病原菌。腐敗菌主要是通過對食品成分的分解和破壞，同時產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對人體造成危害。腐敗菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。食品中污染微生物的檢測方法通常是平板計數(shù)法，其操作繁瑣，檢測時間長，特別是對于病原菌的檢測，有時長達l-2周才能出結(jié)果，因此各種快速檢測方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測方法就是其中的一種。

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1.腐敗菌的檢測釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見的食品腐敗菌。

2.病原菌的檢測常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測方法檢測時間很長，而采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。目前，上述病原菌都可以用相應的生物傳感器來測定。

第29頁/共134頁（四）生物毒素的檢測

污染食品的生物毒素主要包括細菌毒素、真菌毒素、藻類毒素以及動植物毒素，其中以細菌毒素和真菌毒素最為常見。檢測毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液相色譜、薄層層析等）和生物學方法等，這些方法檢測時間長，對樣品的前處理復雜繁瑣。以免疫學方法和生物傳感器檢測方法為代表的各種快速方法備受歡迎。

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1.細菌毒素的分析細菌毒素是由細菌分泌產(chǎn)生于細胞外或存在于細胞內(nèi)的致病性物質(zhì)，有內(nèi)毒素和外毒素之分。

內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分之一的脂多糖，熱穩(wěn)定，抗原性差，不能轉(zhuǎn)化為類毒素，毒性比較弱，毫克水平才能引起動物死亡。外毒素：細菌（主要是革蘭氏陽性菌，也有少數(shù)革蘭氏陰性菌）分泌于胞外的一種蛋白質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，抗原性強，能轉(zhuǎn)化成類毒素，毒性很強，微克水平就能引起動物死亡。目前研究報道主要集中在運用免疫生物傳感器分析檢測肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細菌外毒素。運用生物傳感器能靈敏、準確、快速地檢測到它們在火腿和奶油等食品中的含量。

第31頁/共134頁第32頁/共134頁2.真菌毒素的分析真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。常見的污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭霉素、雜色曲霉素、T-2毒素、腐馬素、鐮刀菌烯醇類毒素、展青霉素和橘霉素等。檢測食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等。近二十多年來免疫學方法在真菌毒素的檢測中得到了較好的應用，以此為基礎的免疫生物傳感器快速檢測真菌毒素的方法也有研究報道和應用，其中以免疫傳感器用于檢測黃曲霉毒素B1和腐馬素B1的研究報道最多。此外，也有運用微生物傳感器和以纖毛蟲為生物敏感材料的傳感器檢測展青霉素、黃曲霉毒素B1和T-2毒素的研究報道。

3.其他生物毒素的檢測也有用于檢測食品中污染的動植物毒素。

第33頁/共134頁（五）食品新鮮度的分析

1.魚鮮度傳感器魚死亡后，魚肉中ATP（三磷酸腺苷）在ATP酶的作用下分解成ADP（二磷酸腺苷），ADP在磷酸激酶的作用下分解產(chǎn)生AMP（一磷酸腺苷），AMP在AMP脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為IMP（肌苷酸），IMP在5’-核苷酸酶的作用下分解成HxR（肌苷），HxR在核苷磷酸化酶的作用下分解成Hx（次黃嘌呤），Hx在黃嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→尿酸

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根據(jù)魚死亡后，魚肉中ATP分解代謝后各種代謝產(chǎn)物之間的比例關系，即K值或K1值也能很好地評判魚的新鮮度。

K值：指上述ATP代謝產(chǎn)物中，肌苷和次黃嘌呤占ATP代謝產(chǎn)物總量的百分數(shù)。即：K（%）=[（HxR+Hx）／（ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx）]×100

魚死亡后ATP、ADP和AMP的代謝非?？?，一般在很短的時間（24h）內(nèi)，它們在魚肉中的含量就幾乎為零，而一般在市場上出售的魚都是死亡24h以后的魚，K值可簡化為K1值。即：

K1（%）=[（HxR+Hx）／（IMP+HxR+Hx）]×100第35頁/共134頁

目前日本等國已制訂了根據(jù)K值或Kl值判斷魚新鮮度的標準，也成功研制了測定K值或K1值的各種生物傳感器。按照日本的標準，K1＜0.2時，魚的品質(zhì)極好，Kl=0.2-0.4時，魚品質(zhì)較好。（1）多電極傳感器系統(tǒng)。主要由四根氧電極組成，其中一根作為參照，另外三根電極的表面分別固定有黃嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，5’-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，測定時將四根電極同時放入樣品液中，上述三根酶電極產(chǎn)生的電信號分別反應了樣品液中Hx的濃度，（HxR+Hx）的濃度和（IMP+HxR+Hx）的濃度，通過計算機處理很容易計算出K1的大小。運用該傳感器，只需20-50μL樣品液，8min就可以測定K1值。

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（2）多酶電極傳感器系統(tǒng)。首先將5’-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶固定在一氧電極上，形成多酶電極。測試時，樣品液先經(jīng)過一離子交換柱，使IMP、HxR和Hx分開，然后分別流經(jīng)有多酶電極的測試室，根據(jù)樣品中不同組分流經(jīng)測試室時電信號的響應情況，運用計算機分析計算出K1值。除了測定K1值，也有通過生物傳感器測定魚肉中胺類物質(zhì)的變化來反應魚新鮮度的研究報道。另外，采用微生物傳感器測定魚鮮度的研究也有報道。

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2.肉鮮度傳感器和魚肉一樣，其他肉類也可以通過生物傳感器來測定其鮮度。Kurube等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了測定豬肉鮮度的酶傳感器，該傳感器的響應時間為4min,檢測的線性范圍為5×10-6-10×10-6mo1／L。Kress等人研制開發(fā)出一種測定肉鮮度的匕首式生物傳感器，測定時將傳感器的探頭插入肉表面2-4cm深度，通過測定葡萄糖的濃度來評價肉的鮮度。

3.牛乳鮮度傳感器主要通過測定牛乳中的微生物數(shù)量，牛乳的乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來評價牛乳的鮮度。

第38頁/共134頁第39頁/共134頁第二節(jié)免疫學技術與食品安全檢測

（一）抗原（antigen）指進入動物體內(nèi)能刺激動物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的物質(zhì)。

1.抗原的分類和基本屬性

半抗原（hapten）:不能刺激動物產(chǎn)生抗體，只能和對應的抗體進行特異性結(jié)合，即只有免疫反應性，無免疫原性的抗原。一、抗原與抗體第40頁/共134頁

完全抗原（completeantigen）：既具有免疫原性又具有免疫反應性的抗原。超級抗原（superantigen）：有些物質(zhì)，例如某些細菌毒素，具有非常強的免疫刺激能力，通?？蛇_到一般抗原刺激能力的2000倍，只需極低的濃度就可以誘發(fā)極大的免疫反應。

免疫原性（immunogenicity）:指抗原進入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞的特性。

免疫反應性（immunoreactivity）:指抗原能和對應的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的特性。第41頁/共134頁

2.抗原決定簇（antigenicdeterminant）或稱為抗原表位，是位于抗原物質(zhì)分子表面或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構的特殊化學基團，能與免疫系統(tǒng)中淋巴細胞上的受體及相應的抗體分子結(jié)合，是免疫原引起機體特異性免疫應答和免疫原與抗體特異性反應的基本構成單位。在蛋白質(zhì)抗原中，3-8個氨基酸殘基可以構成一個抗原決定簇，在多糖抗原中3-6個呋喃環(huán)可以組成一個抗原決定簇。從結(jié)構上抗原決定簇可以分成順序決定簇和構象決定簇。第42頁/共134頁

順序決定簇（sequentialdeterminant）：又稱為連續(xù)決定簇，氨基酸的排列順序決定著這類決定簇的功能基團。構象決定簇（conformationaldeterminant）：又稱為不連續(xù)決定簇，是依賴于蛋白質(zhì)天然空間構象的決定簇，這類決定簇通常由不連續(xù)的氨基酸順序片段經(jīng)肽鏈的折疊卷曲而成，一般位于蛋白質(zhì)的表面。研究抗原的決定簇不僅可以揭示抗原與抗體結(jié)合的本質(zhì)，有助于更好地了解免疫學中的核心問題－免疫識別和應答的機制，而且可以人工合成某些抗原決定簇，這對于研制疫苗和特異性診斷試劑，以及藥物合成和抗病毒感染等方面都有很大的益處。

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3.抗原的分類根據(jù)來源抗原可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原等三類。

天然抗原：是天然的生物、細胞及天然產(chǎn)物，主要來自動物、植物和微生物，例如血細胞、細菌和病毒、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等都可以是天然抗原。

人工抗原：指人工化學改造后的抗原，例如半抗原經(jīng)化學改造后就是人工抗原。

合成抗原：指化學合成的具有抗原性質(zhì)的分子，主要是氨基酸的聚合物。

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4.抗原的制備

（1）抗原的準備。對微生物細胞等顆粒狀抗原，只需對微生物進行擴大培養(yǎng)，然后收集菌體即可。對蛋白質(zhì)、多糖、DNA和脂類等可溶性膠體抗原，應根據(jù)其在生物細胞中的部位進行處理。存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)首先應破細胞壁，使它們釋放出來，然后收集含有這些物質(zhì)的溶液，再采用各種分離、提取和純化方法進行分離和提取。對于分泌于細胞外的這些高分子物質(zhì)則只需收集胞外液，然后再進行分離純化即可。

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（2）半抗原的改造。通常是將牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OV）或人工合成的多聚氨基酸等連接在半抗原分子上，增加其相對分子質(zhì)量，從而使其轉(zhuǎn)化成完全抗原（例子見書）。將各種半抗原轉(zhuǎn)化成完全抗原的具體操作方式和注意事項各不相同，但是有一點必須注意，即在操作過程中應盡可能保持半抗原結(jié)構的“完整性”，不能過度破壞其結(jié)構，以保持半抗原的“原始性”。

第46頁/共134頁（二）抗體（amtibody,Ab）

1.抗體的定義、分布和分類由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)分泌的能和相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細胞分泌液中。另外，抗體還存在于某些細胞中。根據(jù)Ig的理化特性和與抗原結(jié)合方式的不同，Ig可以分為類和亞類。

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2.抗體的結(jié)構一個抗體分子通常包括兩個完全相同的輕鏈分子（1ightchain）和兩個完全相同的重鏈（heavychain）分子，輕鏈分子大約由210個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為2.3×104；重鏈分子大約由450個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為5.0×104。這4條鏈在氫鍵和二硫鍵（S-S）作用下連在一起，形成“Y”字形結(jié)構。在“Y”字形的兩個支角上，重鏈和輕鏈的N端區(qū)域在一起形成抗原的識別位點。有一段大約110個氨基酸殘基的區(qū)域隨抗體結(jié)合特異性的不同而變化，這端區(qū)域叫可變區(qū)。除可變區(qū)外，抗體分子上還有恒定區(qū)。第48頁/共134頁第49頁/共134頁

3.抗體的制備（1）多克隆抗體的制備以抗原免疫實驗動物可以獲得含有特異性抗體的血清，即抗血清?？寡逯械目贵w是由不同的抗原決定簇刺激不同的B細胞克隆產(chǎn)生，這種抗體又稱為多克隆抗體。制備多克隆抗體包括：實驗動物的選擇。用于制備多克隆抗體的實驗動物包括哺乳類的鼠、兔、羊、馬、驢、豚、鼠、豬、猴、狗和禽類的雞、鴨、鴿子，以及兩棲類的蛙等，其中最為常用的是鼠、兔和羊等。第50頁/共134頁

在選擇實驗動物時首先應考慮抗原的來源和免疫動物的親緣關系。一般來說，兩者的親緣關系越遠則產(chǎn)生的抗體效價越高，相反則抗體的效價越差。實驗動物的年齡和營養(yǎng)狀況與抗體的產(chǎn)生也有密切的關系，年齡太小易產(chǎn)生免疫耐受；而年齡過大或營養(yǎng)不良則動物的免疫能力低下，也不易產(chǎn)生高效價的抗體。選擇好實驗動物后，在注射抗原前應采集少量的動物血清（陰性血清）和抗原進行血清學反應，選擇不和抗原反應的動物進行免疫實驗。第51頁/共134頁

抗原的處理。除了前面敘述的抗原的分離提純和半抗原的改造外，對于可溶性抗原，在注射免疫動物之前通常還需和免疫佐劑進行混合（顆?？乖话銦o需和佐劑混合，可以直接注射），以提高抗原的免疫原性等。佐劑（adjuvant）：是具有增強機體的免疫應答能力，延長抗原在機體內(nèi)的半衰期，降低抗原毒副作用，以使機體產(chǎn)生高效價抗血清的物質(zhì)。最常用的佐劑是福氏佐劑，它分為完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑。

不完全福氏佐劑：由1-6份的液體石蠟和1份羊毛脂充分混合而成。

完全福氏佐劑：在不完全福氏佐劑的基礎上，于使用前添加滅活的（2-20mg／mL）卡介苗混合而成。第52頁/共134頁

動物的免疫。動物的免疫是一個非常復雜的過程，在免疫過程中，對抗原的免疫劑量、注射途徑、加強免疫的時間間隔和加強免疫的次數(shù)等都需要認真綜合考慮。

抗原的劑量應根據(jù)抗原的免疫原性強弱、動物的種類和大小以及抗原的注射途徑等來決定。對于同一種抗原，在一定的劑量范圍內(nèi)，抗原的注射量與免疫反應的強度成正相關，抗原量過大或過小都易產(chǎn)生免疫耐受。免疫動物越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液量為1-2mL，家兔的為2-4mL。第53頁/共134頁

常用的抗原注射途徑包括靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下和皮內(nèi)等，它們對抗原的收速度為靜脈＞脾臟＞淋巴結(jié)＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)。

腹腔注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和淋巴結(jié)注射適合于任何抗原，這些途徑主要是通過刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應答，初次免疫和加強免疫都可以使用。靜脈注射只適合于可溶性抗原和分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應答主要發(fā)生在脾臟。脾臟注射比較適合于微量抗原。

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抗血清的采集、純化和特性鑒定?？贵w的分離純化方法很多，包括中性鹽沉淀法、凝膠柱層析、離子交換柱層析和親和層析等。對收獲后的抗血清或純化后抗體的一些參數(shù)，例如效價、親和力和交叉反應等進行分析非常必要。效價又稱為滴度（titer）：在一定條件下，抗血清經(jīng)系列稀釋后與定量的抗原反應，以能檢測出抗血清存在的抗血清的最大稀釋倍數(shù)，是表達抗血清中特異性抗體相對含量的一個指標。第55頁/共134頁

親和力（affinity）：表示抗原抗體結(jié)合程度的指標，親和力的大小可以用抗原抗體反應的平衡常數(shù)K來表示。抗血清的交叉反應：衡量抗體特性的另一個重要的指標。理論上講，抗體只能與產(chǎn)生該抗體的抗原發(fā)生反應，這是抗體特異性的表現(xiàn)，但實際上抗體還可以和其他抗原發(fā)生反應，即所謂的交叉反應。一方面是由于抗原的不純造成，另一方面不同抗原間相同或類似的抗原決定簇也是產(chǎn)生交叉反應的原因。完全沒有交叉反應的抗體是不存在的，但是交叉反應太強的抗體沒有應用價值。

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（2）單克隆抗體（monoclonalantibody）的制備

制備原理：免疫致敏后的B淋巴細胞具有分泌特異性抗體的能力，但是在體外不能長期存活；而骨髓瘤細胞可以在體外長期存活但不能產(chǎn)生抗體；如將兩種細胞雜交融合后，經(jīng)分離篩選獲得既能在體外長期存活又能針對單一抗原決定簇產(chǎn)生特異性抗體的融合子，就可以獲得單克隆抗體。單克隆抗體是通過B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交獲得，單克隆抗體制備技術又稱為雜交瘤技術。

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（3）生物工程抗體（biologicalengineeringantibody）

應用生物工程技術對抗體進行定向改造獲得的抗體。

抗體的化學修飾：運用雙功能交聯(lián)劑將同位素、酶、毒素和藥物等連接在抗體的Fc片段上，抗體和抗原的特異性結(jié)合發(fā)生在抗體的Fab片段上，交聯(lián)后并不影響抗體與抗原的結(jié)合，交聯(lián)（標記）后的抗體可以作為診斷試劑，也可以作為藥物的定向載體，引導藥物或毒素到達抗原存在部位，使藥物或毒素發(fā)揮更有效的作用，即所謂的“生物導彈”。這樣可以大大減少藥物和毒素等在腫瘤等治療過程中的毒副作用，提高治療效果。

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抗體基因文庫（antibodyrecombinationlibrary）：將不同重鏈和輕鏈的基因隨機組合，克隆到適合的表達載體中，在原核細胞中表達不同的抗體，從而形成一個抗體文庫，運用抗原可以從中篩選到相應的抗體基因?？贵w基因的改造（antibodygenemodification）：將不同來源的抗體基因進行重組，可以獲得所需要的抗體。

催化性抗體或抗體酶：具有催化活性的抗體?？贵w酶和酶一樣具有底物和立體專一性，在反應動力學和競爭抑制等方面也和酶相似。第59頁/共134頁二、常用的免疫學方法（一）免疫學方法的分類

抗原抗體的特異性結(jié)合可以發(fā)生在生物體內(nèi)也可以發(fā)生在體外，用于食品衛(wèi)生和安全檢測的免疫學方法都是抗原抗體的體外反應，通常都需要使用含有特異性抗體的血清，這些方法又稱為血清學反應或血清學方法。根據(jù)給出的檢測結(jié)果是定性的還是定量的，免疫學方法（血清學方法）可以分為定性免疫學方法和定量免疫學方法。第60頁/共134頁

定性免疫學方法：能給出分析樣品中是否含有某種特定的抗原或抗體，或者特定抗原或抗體的含量是否高于或低于某一數(shù)值。

定量免疫學方法：能給出樣品中特定的抗原或抗體的準確數(shù)量。根據(jù)免疫分析過程中是否需要將結(jié)合在一起的抗原抗體復合物和沒有結(jié)合的游離的抗原抗體分離開來，免疫學方法可以分為均相免疫學方法和非均相免疫學方法。

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均相免疫學方法：無須將抗原抗體的復合物和游離的抗原抗體分開，一般在較短的時間內(nèi)就可以得到分析結(jié)果，操作比較簡便，但是通常靈敏度較低，一般僅適合于定性分析。

非均相免疫學方法：需要將抗原抗體復合物和游離的抗原抗體等物質(zhì)分開，反應時間較長，操作比較復雜，但是在去除游離抗原抗體的同時也去除了分析樣品中的一些雜質(zhì)，減少了樣品雜質(zhì)對分析結(jié)果的干擾，因此靈敏度和特異性都比較高，適合于定量分析。根據(jù)免疫反應過程中的現(xiàn)象和特征等，免疫學方法又包括凝集反應和沉淀反應等。第62頁/共134頁

凝集反應：顆?？乖ɡ缂毦?、血紅細胞等）或可溶性抗原（抗體）結(jié)合于不溶性的載體微粒上后與相應的抗體（抗原）在適當?shù)臈l件下，經(jīng)一定時間后凝集成肉眼可見的凝聚物。

沉淀反應：可溶性抗原（例如蛋白質(zhì)、多糖、類脂或它們的復合物）與相應抗體在適量的電解質(zhì)存在的條件下發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復合物并出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，這種可見的沉淀只有在抗原抗體比例適合時才能形成，在固體（或半固體）載體中這種沉淀表現(xiàn)為沉淀線，在液體中則常表現(xiàn)為絮狀沉淀。第63頁/共134頁第64頁/共134頁

標記免疫學技術：指抗原（抗體）被酶、同位素和熒光素等標記（連接）后與相應的抗體（抗原）反應，通過測定酶催化反應的產(chǎn)物量、同位素的放射性強度或熒光素產(chǎn)生的熒光強度來計算抗原抗體的結(jié)合量，進而計算出待檢測物質(zhì)（抗原或抗體）量的方法。根據(jù)標記物的不同，標記免疫學技術可以分為酶免疫分析（enzymeimmunoassay）、放射免疫分析（radioimmunoassay）和熒光免疫分析（fluorescentimmunoassay）。第65頁/共134頁（二）酶免疫分析方法（enzymeimmunoassay）

與熒光免疫方法和放射免疫方法（RIA）相比，酶免疫方法（EIA）有很多優(yōu)點。目前，前面兩種方法正逐步被酶免疫方法所取代。

1.靈敏度

EIA的靈敏度比RIA的更高，用于EIA的酶的檢測限值可以達到0.002×10－18～1×10－18mol/100min,個別報道甚至可以檢測出一個酶分子；125I及其標志物最低檢測限值為5×10－18～10×10－18mol/100min。

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2.對人的危害

EIA中酶標物對人體和環(huán)境均無害，使用不受限制；RIA使用的放射性標志物對人和環(huán)境均可能造成危害，使用將可能受到越來越嚴格的限制。

3.檢測儀器

EIA簡便，可自動化也可以半自動化，甚至憑肉眼也可以判讀結(jié)果；RIA檢測儀器價格較貴，難以自動化，肉眼一般不能判斷結(jié)果。

4.試劑的穩(wěn)定性在合適的保存溫度和介質(zhì)中，酶標試劑即使在稀釋的溶液中也可以保存一年至數(shù)年之久；放射性標志物由于受到放射性元素半衰期的限制一般保質(zhì)期較短。

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5.多樣性

EIA可以用于制備標志物的酶種類很多，酶標物的種類多。另外，一種酶標物由底物的不同又可以產(chǎn)生多種檢測信號；RIA可用于制備標志物的放射性元素較少，最常用僅有125I。

6.反應體系要求酶標物反應時對pH值、溫度等要求較嚴格。另外，酶標物需要和底物反應一段時間后才能判讀結(jié)果；放射性標志物對反應體系的要求不高，可以即時判讀結(jié)果。

三種方法最本質(zhì)的區(qū)別是標記物的不同，熒光免疫分析以熒光素為標記物，放射免疫分析以同位素為標記物，酶免疫分析以酶為標記物。由于標記物的不同，具體的分析操作過程也有許多不同。

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三種方法的基本的原理相同，都是以標記物（熒光素、同位素或酶）標記抗原或抗體，之后和相應的抗體或抗原反應，形成帶有標記物的抗原抗體復合物，測定復合物中標記物產(chǎn)生的各種信號，即熒光的強度、放射性強度或酶催化底物產(chǎn)生的產(chǎn)物量，在一定的范圍內(nèi)信號的強弱反映了抗原抗體復合物的量，根據(jù)信號的強弱可以計算出和標記抗原抗體結(jié)合的待測物（抗體或抗原）的量。酶免疫方法至少包括酶標記免疫方法、非標記酶免疫方法和酶免疫電鏡方法。酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）是目前應用得最為普遍的一種酶免疫方法。

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2.酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）（1）原理以96孔、48孔或40孔的聚丙乙烯塑料微孔板（酶標板）為載體，在適當?shù)臈l件下使抗原或抗體上包被（吸附）在酶標板微孔的內(nèi)壁上成為包被（固相）抗原或抗體，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去。然后直接加入酶標記抗體或抗原形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔或試管，沒有吸附的酶標記物洗滌去除。加入酶底物溶液（通常沒有顏色）于微孔中，復合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的產(chǎn)物。在一定的條件下，復合物上酶的量（也反應了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的含量。

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（2）分類直接法（directELISA）:指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標抗原抗體復合物，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計算出包被在酶標板上的抗體或抗原的量（圖）。間接法（indirectELISA）:將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結(jié)合形成復合物后，再以酶標二抗和復合物結(jié)合，通過測定酶反應產(chǎn)物的顏色可以反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進而計算出抗原或抗體的量（圖）。第71頁/共134頁第72頁/共134頁

夾心法（sandwichELISA）:先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與之反應形成抗體－抗原酶標抗體復合物；也可以像間接法一樣應用酶標二抗和抗體－抗原－抗體復合物結(jié)合形成抗體－抗原－抗體－酶標二抗復合物（圖），前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。

競爭法：在抗原抗體反應過程中有競爭現(xiàn)象的存在。例子：直接法中的酶標抗原競爭法（見書）。

第73頁/共134頁第74頁/共134頁第75頁/共134頁第76頁/共134頁第77頁/共134頁

（3）ELISA的操作過程試劑的準備：主要試劑有抗原抗體、酶標抗原或抗體、酶和底物等。酶標抗原或抗體是ELISA的核心試劑，這些試劑可以自己制備也有現(xiàn)成的試劑（例如酶標二抗），可以購買。在自己制備酶標物時，除了應準備好純化的抗原和抗體外，還應準備好純化的酶，酶可以自己從動植組織或微生物中提取，但過程復雜，而且純度和活性通常很難保證，最好從試劑公司購買。第78頁/共134頁

酶和抗原或抗體連接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括：以戊二醛為交聯(lián)劑的戊二醛法和以過碘酸鹽為氧化劑的過碘酸氧化法等。

ELISA中常用的酶包括辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β-D-半乳糖苷酶（BG）、脲酶（urease）等，其中HRP和AP應用最多。HRP的底物很多，在ELISA中常用是鄰苯二胺與雙氧水和5-氨基水楊酸與雙氧水等。AP常用的底物是對位硝基酚磷酸酯和酚酞單磷酸酯等。

第79頁/共134頁ELISA的操作過程：間接競爭ELISA測定黃曲霉毒素B1（AFB1）。

抗原的包被（antigencoating）。將AFB1與牛血清蛋白（BSA）的連接物AFB1-BSA（也可以是卵清白蛋白的連接物AFBl-OV）溶解于0.1mol／LpH9.5碳酸鹽緩沖液中，將溶液加入酶標板的微孔內(nèi)，通常每孔加200μL，4℃放置過夜，取出恢復至室溫，傾去微孔內(nèi)溶液（包被液），以含有0.05%的Tween-20的pH7.0的0.05mol／L的磷酸鹽緩沖溶液生理鹽水（PBST）滿孔洗滌三次，每次5min，扣干，即得到包被有AFB1-BSA的酶標板。在這個過程中AFB1-BSA通過物理吸附包被（黏附）在酶標板微孔的內(nèi)壁上，沒有包被的抗原洗滌去除。

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封阻（blocking）。指酶標板被抗原包被后，在微孔中加入一定濃度BSA、OV、明膠或脫脂牛奶等溶液以封阻微孔內(nèi)沒有被抗原包被的空隙，避免抗體的非特異性吸附于這些空隙，以提高實驗結(jié)果的準確性和可靠度的過程。常用的封阻劑包括BSA、OV、明膠和脫脂牛奶等，其中以脫脂牛奶較為便宜，而且封阻效果和其他幾種封阻劑沒有明顯的差別（圖）。

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抗原抗體競爭反應（competitivereactionofantigenandantibody）。在酶標板的每個微孔中加入一定量（例如90μL）的適當稀釋度的抗體（抗血清），同時分別加入一定量（例如10μL）的不同稀釋倍數(shù)的AFB1標準溶液，或待測樣品的抽提液（不同濃度的AFBl標準溶液用于作標準曲線），混勻，37℃保溫保濕1-2h，包被在酶標板上的固定抗原（AFBl-BSA）和添加的AFBl或樣品抽提液中的AFBl等游離抗原競爭抗體的結(jié)合位點，HBST洗滌扣干三次，游離的抗原抗體復合物被洗滌去除。

第82頁/共134頁

酶標二抗與抗原抗體復合物的反應（reaction0fsecondantibodvlabeledenzymeandantigen-antibodycomplex）。將一定量（例如100μL）適當稀釋的酶標二抗溶液加入各反應孔，37℃保溫保濕1-2h，酶標二抗和抗原抗體復合物反應，形成抗原-抗體-酶標二抗的復合物固定在酶標板上，PBST洗滌扣干五次，將游離多余的酶標二抗去除。

底物顯色反應和吸光值的測定（colorreactionsubstrateofODdetection）。每孔加反應底物100μL（40mg鄰苯二胺溶于l00mLpH5.0的0.2mol/L檸檬酸－0.1mo1／L磷酸氫鈉緩沖溶液，加入150μLH2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用），37℃保溫保濕，避光反應30min，每孔加50μLmol／LH2SO4終止反應。5min后，以酶聯(lián)免疫測定儀于490nm測吸光值。第83頁/共134頁

ELISA競爭抑制曲線（competitiveinhibitorycurveofELISA）。以AFBl標準物溶液中的AFBl的濃度對數(shù)為橫坐標，以不同AFB1濃度所對應的吸光值和AFBl濃度為零時吸光值的比值的百分數(shù)（稱為競爭抑制率）為縱坐標，繪制ELISA競爭抑制曲線。根據(jù)樣品抽提液的吸光值，利用競爭抑制曲線，計算出樣品中AFBl的含量。

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（4）ELISA的進展在靈敏度方面，ELISA（包括其他酶免疫方法）的靈敏度依賴于免疫反應試劑（主要是抗體）的特異性（specificity）與親和力（affinity）、酶結(jié)合物的比活度（在酶活性一定的情況下主要是酶的結(jié)合量）和酶反應產(chǎn)物的可檢測極限三方面的因素。近幾年來，圍繞后兩個因素開展了大量的研究，各種放大系統(tǒng)被引入ELISA中，大大提高了ELISA的靈敏度，拓寬了其檢測范圍，而且放大系統(tǒng)的引入并沒有增加ELISA的操作難度，只是在常規(guī)ELISA的基礎上做了一些增添和改進，目前這些方法正逐漸成為ELISA的主流方法，代表著ELISA的發(fā)展方向。

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生物素－親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem,BAS）通過提高酶結(jié)合物的比活度，即酶的結(jié)合量來實現(xiàn)檢測信號的放大，從而提高ELISA靈敏度。親和素（avidin）是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素（biotin，是復合維生素B系統(tǒng)中的一小分子的水溶性因子）有很高的親和力，每個親和素分子可以和四個生物素分子結(jié)合，而生物素非常容易和抗體或酶等蛋白質(zhì)結(jié)合，一個分子的抗體或酶的蛋白質(zhì)可以和多個生物素分子結(jié)合，并且生物素和蛋白質(zhì)結(jié)合后并不影響它和親和素的親和力。這樣過BAS可以將大量的酶標記物結(jié)合在抗原抗體復合物上,從而增加檢測信號的強度，提高靈敏度。目前BAS在ELISA中得到了廣泛的應用。第86頁/共134頁

由于親和素是pI值較高的糖蛋白，對以聚苯乙烯為材料的酶標板等有較高的非特異性吸附，因此在BAS的ELISA中容易出現(xiàn)一些假陽性。最近一種由阿維丁鏈霉菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有和親和素相似的性質(zhì)，被稱為鏈親和素（streptavidin），它的pI僅為6.0，其非特異性吸附遠遠小于親和素，近年來日益受到重視，有取代親和素之勢。第87頁/共134頁

熒光酶免疫分析（fluorescenceenzymeimmunoassay）將熒光底物取代ELISA中的普通底物，熒光底物在酶的催化下產(chǎn)生熒光，通過測定熒光的強度來測定抗原抗體的反應，這樣可以大大地提高ELISA的靈敏度。。目前ELISA中常用的三種酶，辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）和β-D-半乳糖苷酶（BG）都有相應的熒光底物，測定熒光強度的儀器也得到了很大的改進，熒光酶免疫技術正越來越被廣泛地采用。

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化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminessenceenzymeimmunoassay）和熒光酶免疫分析一樣，化學發(fā)光酶免疫分析也是通過提高酶反應產(chǎn)物的可檢測極限來提高ELISA靈敏度的一種方法。本方法將化學發(fā)光的物質(zhì)引入酶免疫分析中，通過測定光強來分析抗原抗體的反應。和一般的酶免疫方法（ELISA）相比，測定光強可以提高靈敏度。除了上述幾種提高ELISA靈敏度的方法外，通過酶級聯(lián)放大和酶抗酶抗體復合物系統(tǒng)也可以提高ELISA的靈敏度。

第89頁/共134頁（五）其他免疫學方法

免疫學方法由于具有特異、靈敏和快速等特點而愈來愈受到重視，目前主要是從提高檢測方法的靈敏度、縮短檢測時間和實現(xiàn)檢測過程的自動化等幾個方面來改良和開發(fā)免疫學方法。最近幾年Biocontrol公司和Neogen公司相繼先后推出了沙門氏菌（Salmonellaspp.）、李斯特菌（Listeriaspp.）、大腸桿菌O157：H7（EscherichiacoliO157：H7）、彎曲桿菌（Campylobacterspp.）的快速免疫檢測試劑條（teststrip）；Charm公司等推出了快速檢測黃曲霉毒素的試劑條。這些檢測產(chǎn)品的推出大大地縮短了檢測時間。

第90頁/共134頁第91頁/共134頁

檢測試劑條雖然形狀各異，但是它們的基本組成和檢測原理是相同的。它們通常以長條狀的硝酸纖維素膜為支撐物，被膠體金標志的抗體吸附（黏附）于膜的一端，其前方有一樣品孔（槽），在膜的另一端分別有一條對照帶和反應帶（在沒有反應前這兩條帶通常是看不見的）（圖）。使用時，將一定量（通常100μL左右）的樣品提取液或微生物的富集液加入樣品槽中和膠體金標志的抗體反應，并沿纖維素膜向另一端移動擴散，與反應帶和對照帶反應顯色，比較反應帶和對照帶的顏色深淺就可以判斷出食品樣品中是否含有某種有害物質(zhì)（微生物）或其含量是否超標。

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在快速檢測方面，Clover公司推出了快速檢測金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的乳膠檢測試劑，2min就可以得出結(jié)果。在免疫檢測方法的自動化方面，近些年來出現(xiàn)了很多自動化的免疫分析儀器，例如BioMerieux公司推出的VIDAS自動化免疫檢測儀。

工作原理:將熒光酶聯(lián)免疫分析所需的所有試劑預先分裝在同一試劑條的不同孔內(nèi)，然后由儀器自動完成整個分析檢測的全過程，加入樣品后，無需再進行人工操作，60min左右就可以給出結(jié)果。將抗原抗體的特異性反應特性和相應的儀器相結(jié)合實現(xiàn)檢測的自動化也是免疫學方法發(fā)展的趨勢。

第93頁/共134頁第94頁/共134頁三、免疫技術在食品安全檢測中的應用

（一）免疫技術在食品污染細菌及其毒素檢測方面的應用

很早以前，免疫學技術在細菌的病原性和血清型檢測與鑒定方面就得到了廣泛的應用。在食品安全方面，常見的污染食品病原細菌，例如，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等，都可以通過免疫學方法進行分析和檢測。第95頁/共134頁

病原微生物產(chǎn)生分泌于食品中的毒素，例如，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素、肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒毒素、大腸桿菌腸毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素等，也可以用免疫學方法來檢測和分析。檢測上述病原菌及其毒素的免疫學方法包括免疫沉淀法、免疫絮凝法、放射免疫分析方法和酶免疫分析方法等各種免疫學方法。

第96頁/共134頁（二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析

食品中污染真菌的免疫學分析方法的研究開始于20世紀80年代中期，但是食品中常見的污染真菌的免疫學檢測方法大都被研究過。到目前為止，食品中常見的污染真菌，已有地霉屬、根霉屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢霉屬、毛霉屬、擬莖點青霉屬、分枝霉屬、腐質(zhì)霉屬、散囊菌屬、鐮孢霉屬等10多個屬被研究過，并獲得了相應的特異性抗原和抗體。第97頁/共134頁

食品中污染真菌毒素免疫檢測方法的研究開始于20世紀60-70年代，起初用于真菌毒素的免疫學檢測方法是放射免疫方法。目前真菌毒素的檢測方法主要是酶免疫方法，20世紀80年代中后期已有酶免疫檢測真菌毒素的商品試劑盒銷售。食品中常見的污染真菌毒素，例如，黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、串珠鐮刀菌毒素、雜色曲霉素、伏馬素、橘霉素和展青霉素等都有商品試劑盒出售，用以檢測玉米、稻谷、大米、花生、小麥、大麥、棉子、牛奶、肉類及其制品等中污染的各種真菌毒素。近幾年來真菌毒素的快速檢測方法和試劑也相繼問世。

第98頁/共134頁（三）食品中農(nóng)藥殘留的免疫學方法檢測食品中的農(nóng)藥殘留包括除草劑殘留、有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類等殺蟲劑的殘留。目前農(nóng)藥殘留的檢測手段主要是毛細管氣相色譜和高效液相色譜及其聯(lián)用技術。免疫學方法用于食品中農(nóng)藥殘留檢測和分析的研究大約開始于十多年前。由于具有快速、靈敏、特異、操作簡便、無須昂貴的儀器設備和可以在采樣現(xiàn)場分析等優(yōu)點，已成為當今農(nóng)藥殘留檢測技術的主要發(fā)展方向之一，越來越受到人們的重視。

第99頁/共134頁（四）食品中抗生素殘留的免疫檢測食品中的抗生素殘留主要包括：農(nóng)用抗生素、畜用抗生素。食品中抗生素殘留的分析檢測方法主要有薄層層析（TLC）、液相色譜（LC）、氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC／MS）、微生物抑制實驗、微生物受體實驗、免疫學方法以及這些方法相互結(jié)合在一起的衍生方法。例如，微生物抑制實驗和液相色譜結(jié)合在一起的生物色譜。免疫學方法作為其中的一種檢測方法，近年來愈來愈受到重視。目前德國的г-biopham公司和意大利的Tecnalab公司等已有檢測食品中磺胺類抗生素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、新霉素、泰樂菌素和慶大霉素等抗生素殘留的免疫檢測試劑盒出售。

第100頁/共134頁（五）食品中摻假物的免疫學識別

免疫學方法在識別食品中摻假物方面也發(fā)揮著重要的作用。例如，在綿羊奶或山羊奶奶酪的生產(chǎn)中，如果原料奶中摻雜有牛奶成分將影響綿羊（山羊）奶奶酪的品質(zhì)和加工特性，因此在加工過程中應避免牛奶的摻入。通常的分析方法，包括電泳技術一般很難鑒別出羊奶中是否摻雜有牛奶。以牛奶中特有的酪蛋白為抗原，制備抗體，然后再運用免疫學方法就能夠很容易地鑒別出羊奶中是否摻有牛奶。由于牛奶中特有的酪蛋白的耐熱性好，因此免疫學方法對于殺菌或消毒后的奶及其乳酪制品中是否含有牛奶成分也可以進行分析和鑒別。同樣原理的免疫學方法也可以快速鑒別綿羊奶中是否摻雜有山羊奶。目前德國的г-biopham公司已有上述免疫試劑盒銷售。第101頁/共134頁（六）免疫學方法在分析樣品凈化中的應用

依據(jù)抗原抗體的特異反應特性，應用免疫學方法可以快速地從樣品中分離凈化需要分析的成分，然后再進行分析。例如，VICAM公司的凈化真菌毒素的免疫親和層析柱，就是先將抗黃曲霉毒素、伏馬素、T-2毒素或赭曲霉毒素的抗體包被在葡萄糖凝膠或瓊脂糖凝膠顆粒上，然后將它們裝入小柱內(nèi)制成，它們具有從樣品中快速分離純化這些真菌毒素的作用。使用時將樣品的提取液加入親和柱中，并依次用不同的洗脫劑洗脫，就可以得到純凈的真菌毒素，經(jīng)過凈化后的毒素可以用免疫學方法或HPLC等進行分析和測定。經(jīng)過親和柱凈化后可以大大地提高檢測方法的靈敏度，減少樣品雜質(zhì)對分析的干擾，提高分析結(jié)果的準確性。

第102頁/共134頁第三節(jié)生物芯片及其在食品安全檢測中的應用

（一）定義

第一種是認為DNA芯片或基因芯片（DNAorgenechip）就是生物芯片，這主要是因為DNA芯片出現(xiàn)最早，研究最多，應用最成功。第二種認為生物芯片主要包括DNA芯片和蛋白質(zhì)芯片（proteinchip），因為到目前為止這兩種芯片最為成功。第三種是將微流路生物分析系統(tǒng)也歸入了生物芯片的范疇。

一、生物芯片的定義及分類第103頁/共134頁

生物芯片：按預先的設置排列固定有大量生物識別分子（例如DNA片段、RNA片段、抗原抗體分子或蛋白質(zhì)或肽分子）的面積很?。ㄍǔＶ挥幸坏綆灼椒嚼迕祝┑墓杵?、載玻片或高分子聚合物薄片。工作原理：將待檢測樣品加在芯片的表面，由于生物分子特異性親和反應（如核酸雜交反應、抗原抗體反應等），檢測樣品中的待檢測成分分別和芯片上固定化的生物識別分子結(jié)合反應，從而實現(xiàn)對樣品的分析和檢測。生物芯片可以在很小的面積上并行分析成千上萬種生物分子，分析結(jié)果的可比性好，試劑的消耗量少，并可實現(xiàn)微型化和自動化。

第104頁/共134頁第105頁/共134頁（二）分類

根據(jù)芯片上固定的探針不同，生物芯片可分為DNA芯片（DNAchip）和蛋白質(zhì)（肽）芯片（proteinorpeptidechip）等。

DNA芯片：又稱為DNA微陣列。按特定的排列方式排列固定有大量基因片段（可以是相同的基因片段，也可以是不同的）的硅片、玻璃片或塑料片。工作原理：將樣品加在芯片上，通過分子雜交方式對樣品進行分析，從而大規(guī)模高效地獲取相關的生物信息。

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蛋白質(zhì)芯片：又稱為蛋白質(zhì)微陣列。將大量的蛋白質(zhì)分子（例如抗體或抗原分子）或肽鏈有序排列固定在載體薄片上形成。工作原理：利用蛋白質(zhì)或肽能特異性地與配體分子（如抗原或抗體）結(jié)合的原理，芯片上的蛋白質(zhì)分子或肽鏈與樣品中的相關成分發(fā)生反應，然后加入標記分子，并用閱讀儀分析和存儲結(jié)果。其他有可能開發(fā)成功的芯片還有藥物受體芯片、激素芯片、多糖芯片、細胞芯片、組織芯片等。第107頁/共134頁

根據(jù)芯片的用途，生物芯片可以分為樣品制備芯片、生化反應芯片、檢測芯片、芯片實驗室等。樣品制備芯片：用于制備樣品的芯片，它可以將通常在實驗室需要多個操作步驟才能完成的工作集中于一個芯片上完成。生化反應芯片：用于進行生物化學反應的芯片。與傳統(tǒng)生化反應過程相比，生物芯片可以高效、快速、經(jīng)濟地完成生物化學反應。目前研究得比較多的生化反應芯片是PCR芯片。

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檢測芯片：用來檢測生物樣品的芯片。前面敘述的DNA芯片和蛋白質(zhì)（肽）芯片都屬于檢測芯片。芯片實驗室：將各種功能的芯片集約在同一載體片（通常為硅片）上，形成的（復合）多功能芯片。芯片實驗室技術有望將實驗室進行的樣品制備、生化反應和檢測等過程部分或全部地集約“濃縮”在一起，這也是生物芯片技術發(fā)展的最終目標。

第109頁/共134頁二、生物芯片的制備方法（一）DNA芯片的制備方法

1.載體及其活化作為生物芯片的載體材料至少應滿足以下要求：①載體表面必須有足夠多的活性基團，以便與生物分子進行偶聯(lián)；②載體應有相當?shù)亩栊院妥銐虻姆€(wěn)定性。惰性是指載體的其他性能或特異性吸附不應該干擾生物大分子的功能；穩(wěn)定性（包括機械的、物理的和化學的穩(wěn)定性）是指載體遭受一定的壓力或酸堿條件后不會發(fā)生變化；③載體應具有很好的生物兼容性。

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目前用作生物芯片的載體材料主要有玻璃片、金屬片、硅片和各種有機高分子制作的薄膜或薄片，其中玻璃片是最常用的載體材料。優(yōu)點：來源方便；表面有足夠多的羥基，便于在適當處理后或直接和生物大分子偶聯(lián)；透光性好，適合于發(fā)光檢測；采用光刻蝕方法可以在其表面刻出微流路。載體的活化：指采用不同的活化試劑通過化學反應在載體表面鍵合上各種各樣的活性基團，以便和生物大分子共價結(jié)合。

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2.DNA芯片的制備方法

點樣法：將合成好的DNA和cDNA等片段通過點樣的方式直接點接于載體上。原位合成法：以單核苷酸為原料在載體表面直接合成DNA片段（寡核苷酸片段）。根據(jù)點樣方式的不同，點樣法又可以分為打印點樣和噴印點樣兩種，在打印點樣中點樣針頭與芯片直接接觸，而噴印的點樣針頭與芯片保持一定距離（圖）。兩種點樣方法各有優(yōu)缺點，打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1cm2可打印點樣2500個點，缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限；噴印法的優(yōu)點是定量準確，重現(xiàn)性好，使用壽命長，缺點是噴印的斑點大，國此點樣密度較低，通常1cm2只能點400個點（表）。

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原位合成法主要包括原位噴印合成法和原位光解保護基合成法兩種。原位噴印合成法的原理：與噴墨打印類似，不過噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是墨水，噴印頭可在整個芯片上移動，并根據(jù)芯片上不同位點DNA片段的序列需要，將特定的堿基噴印在芯片特定的位置進行合成，該技術采用的合成原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，無特殊制備的化學試劑。

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原位光解保護基合成法的原理：首先活化載體上的基團（如羥基）并偶聯(lián)上光保護基團，然后在載體表面覆蓋上一層具有半透明區(qū)和不透明區(qū)間隔的掩蔽膜，將光束通過掩蔽膜照射載體，光線通過半透明區(qū)照射到載體上使被照射部位光解保護基團光解脫落，被保護基團激活（而不透明區(qū)的光解保護基團不脫落，被保護基團不激活），被激活的基團和帶有光解保護基團的單核苷酸反應結(jié)合。重復上述過程逐步增加核苷酸的數(shù)量就可以合成適當長度的特異性的寡核苷酸片斷（圖）。目前通過原位光解保護基合成法可以在1cm2的載體表面上合成約40萬個寡核苷酸片斷。

第115頁/共134頁（二）蛋白質(zhì)（肽）芯片的制備方法點樣法：將合成并提取純化的蛋白質(zhì)或肽直接點接在活化載體的表面，使其與載體的活化基團結(jié)合而固定在載體上。原位合成法：主要用于肽芯片的制備，和DNA原位光解保護基合成法一樣，先將載體表面的活性基團以光解保護基團保護起來，然后光線通過掩蔽膜照射到載體表面，使光解保護基團選擇性脫落，被保護基團激活，再將帶有保護基團的氨基酸結(jié)合上去。重復上述過程就可以得到結(jié)合（固定）有一定長度肽鏈的肽鏈芯片（圖）。

第116頁/共134頁第117頁/共134頁（三）微流路刻蝕技術（microfluidetchingtechnique）微流路刻蝕通常在硅片上采用光刻平板印刷技術（opticalsculpturingplateprintingtechnique）進行。光刻平板印刷技術包括光敏膠涂漬、光刻和刻蝕（或增厚）三個基本的過程。光敏膠涂漬：將光敏感聚合物均勻涂在硅片上，蒸干溶劑，形成光敏層。然后在光敏層上覆蓋掩蔽膜（和DNA芯片制備中的掩蔽膜一樣，掩蔽膜上以半透明區(qū)和不透明區(qū)間隔繪制了預先設計的圖案），以光照射掩蔽膜，光線通過掩蔽膜的半透明區(qū)照射到光敏層上使被照部位曝光，不透明區(qū)覆蓋的光敏層由于不被光線照射而不曝光。

第118頁/共134頁三、生物芯片的應用

（一）DNA芯片的應用

1.DNA序列測定傳統(tǒng)的兩種測序方法（Sanger和Maxam-Gilbert），在效率、費用和可靠性等方面都不能滿足人類基因組測序的需要，很多高效快速測序方法相繼誕生，雜交測序（SBH）和鄰堆雜交（CSB）就是其中的兩種。

第119頁/共134頁SBH是最初發(fā)展起來的DNA芯片技術，其過程：首先將未知序列的單鏈DNA片段和DNA芯片進行雜交，互補序列形成雙鏈，然后通過分析鑒定雙鏈體的情況就可以得出未知DNA的序列。在SBH技術中，其效率隨著芯片中寡核苷酸數(shù)量及其長度