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基因打靶——TALEN正向遺傳學(xué)VS反向遺傳學(xué)目前常用的遺傳學(xué)技術(shù)Forwardgenetics:
Chemicalmutagenesis(EMS,ENU)
Insertionalmutagenesis(retrovirus,transposon)
Genetrap(transposon)
Naturalmutationscreen
Phenocopy(transienteffect):
RNAi
Morpholino(MO)antisenseoligonucleotides
Reversegenetics:
KnockoutbyHR:viaplasmidinEScell(mouse)
viarAAV
GenetargetingbyZFNandTALEN
ShortinterferingRNAs—post-transcriptionalgenesilencingMorpholinostructureandfunctions細胞內(nèi)的穩(wěn)定性基因表達敲低的效率細胞毒性免疫應(yīng)答進入細胞的方式是否可遺傳RNAiandMorpholino:TheNobelPrizeinPhysiology2007--thebeginningofaneweraingeneticsTheratesofrecombinationinmammaliancellstypicallyfallintherangeof10-6-10-5
eventspercellpergenerationTALEfamilywasfirstidentifiedfrombacterialplantpathogensTALE:TranscriptionActivator-LikeEffectorHrp-typeIIIsecretion(T3S)systemisessentialforpathogenicityofmostxanthomonads(黃單胞菌)BasicstructureofTALEfamilyproteinsThecoreofTALEisarepeatregion
Eachrepeatcontainsof33-35aa
Numbersofrepeatsspreadfrom1.5to33.5,withthepeakat17.5Group1:validatedviaexperiment“WithTALeffectorsit’sreallyamazing.IfIseetheaminoacidsequenceoftheTALrepeat,andknowthevariableaminoacidresidues,Icanpredictwhatsequenceitwillbind.Conversely,seeingaDNAsequence,withfewexceptions,wecandesignaTALeffectorthatrecognizesthissequence.”(MahfouzMMandLiL,2011)PotentialapplicationsofTALEfactors(MahfouzMMandLiL,2011)TALEN(TALENuclease)MethodsforTALERepeatConstructionDenovosynthesis
Goldengateassembly
(TypeIIsrestrictionenzyme)
SimilarwithGoldenGateTALENtargetsitepredictionTALEN的應(yīng)用:模式生物的基因敲除InvitroTranscriptionMicroinjection基于EScel和同源重組的基因敲除TALEN的基因敲除2-6月3月3月5-10天3月
將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄激活因子VP64融合,表達的融合蛋白結(jié)合啟動子附近的特異DNA序列,
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