人鼻病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒實驗原理

人鼻病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒說明書產(chǎn)品名稱：人鼻病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒英文名稱：HumanRhinovirus16產(chǎn)品規(guī)格：50次運輸：低溫保存：負20度有效期：一年貨期：現(xiàn)貨特點優(yōu)勢：1.特異性：2.重現(xiàn)性：3.靈敏性：4.實用性：PCR實驗方法步驟：方法1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2：調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循環(huán)30-35次，在72℃保7min。3：結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。產(chǎn)品僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。3.細胞上清液：16人鼻病毒16PCR檢測試劑盒廠家3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。需要自備的器材：1．產(chǎn)品僅用于科研儀器：分析天平、離心機、熒光PCR擴增儀、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。2．耗材：熒光PCR專用反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5mL經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10μL、200μL、1000μL）、滅菌雙蒸水。特點：1.廠家即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板，操作簡單，定量準確快速。2.引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性強。預期的PCR產(chǎn)物長度為560bp。3.PCRmix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。4.提供陽性對照，便于分析試驗結(jié)果。操作流程：1.整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。2.為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。3.每次實驗應該設置陰、陽性對照。4.試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。6.為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。7.儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。8.ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。儲存條件：14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：