10-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)-試驗指導(dǎo)課件

WORD完美格式編輯液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測技術(shù)實驗指導(dǎo)（2014、2015級）課程內(nèi)容（一個實驗8學(xué)時）：（1）ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結(jié)構(gòu)原理、操作及定性定量應(yīng)用。（2）利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速測定水果中 7種農(nóng)藥的殘留量。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部參茸質(zhì)檢中心2017.03專業(yè)資料整理WORD完美格式編輯實驗一ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結(jié)構(gòu)原理、操作及定性定量應(yīng)用一.實驗?zāi)康暮鸵饬x通過學(xué)習(xí)液質(zhì)聯(lián)用儀的構(gòu)成和使用方法，及其在定性、定量分析中的應(yīng)用，培養(yǎng)學(xué)生使用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行儀器分析的能力，并培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、細(xì)致的工作作風(fēng)、實事求是的數(shù)據(jù)報告和良好的實驗習(xí)慣（準(zhǔn)備充分、操作規(guī)范，記錄簡明，臺面整潔、實驗有序，良好的環(huán)保和公德意識）。培養(yǎng)培養(yǎng)學(xué)生的動手能力、理論聯(lián)系實際的能力、統(tǒng)籌思維能力、創(chuàng)新能力、獨立分析解決實際問題的能力、查閱手冊資料并運用其數(shù)據(jù)資料的能力以及歸納總結(jié)的能力等。（一）檢測儀器儀器名稱高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（簡稱LC-MS-MS）。型號：4500QTRAP（美國AppliedBiosystems公司）。儀器組成液相色譜部分：島津 LC-30A，配有在線脫氣機、超高壓二元泵、自動進(jìn)樣器；串聯(lián)質(zhì)譜部分： QTRAP4500，配有ESI離子源、串聯(lián)四級桿/線性離子阱。3、主要性能指標(biāo)離子化方式：ESI電離質(zhì)量范圍：（5~1700）amu分辨率：＞6900質(zhì)量穩(wěn)定性：0.1amu/12h靈敏度：1pgreserpine,ESI+,MRM掃描（m/z:609/195），信噪比S/N＞120:1掃描速度：4000amu/sec質(zhì)量準(zhǔn)確度：＜0.01%（全質(zhì)量數(shù)范圍）4、方法原理高效液相色譜二元泵將流動相泵人系統(tǒng)并混合，自動進(jìn)樣器將待測樣品注入流動相中，隨流動相進(jìn)入色譜柱，由于樣品不同組分在色譜柱中保留時間不同，各組分被分開，依次進(jìn)入離子源。在離子源中，各組分以ESI或APCI方式電離，被加速后進(jìn)入質(zhì)量分析器。 4500QTRAP的質(zhì)量分析器主要由Q1、Q2、Q3三組四級桿串聯(lián)組成。 Q1可將分子離子按質(zhì)荷比（m/z）大小分開；Q2是碰撞室，可將母離子進(jìn)一步破碎為碎片離子； Q3具有四級桿和線性離子阱兩種功能，作為四級桿時可將分子離子或碎片離子按質(zhì)荷比大小分開，作為離子阱還可富集離子從而提高檢測靈敏度。各組分的不同離子在質(zhì)量分析器中被破碎、分離，并按質(zhì)荷比大小依次抵達(dá)監(jiān)測器，經(jīng)記錄即得到按不同質(zhì)荷比排列的離子質(zhì)譜圖。 4500QTRAP通過串聯(lián)四級桿/線性離子阱兩種不同質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，可以在單次分析中對復(fù)雜樣本中的單個成分同時進(jìn)行定性和定量，也可以對多個化合物進(jìn)行定量分析。整臺儀器的控制、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果輸出均由 PC計算機Windows操作系專業(yè)資料整理WORD完美格式編輯統(tǒng)支持下的Analyst軟件控制完成。（二）樣品1、樣品要求本儀器適合分子量在5~1700amu范圍內(nèi)的有機樣品的定性及定量分析。待測樣品必須能溶解于水或其它有機溶劑中。若樣品或配制的樣品溶液發(fā)生沉淀、揮發(fā)、變質(zhì)等異常現(xiàn)象時，應(yīng)重新取樣或重新配制溶液。2、試劑要求所有的試劑均選用色譜純級， 所用水的電導(dǎo)率應(yīng)大于 18KQ。流動相必須用0.2m或0.45m濾膜過濾后方可使用。3、分離條件要求 在液相色譜儀上確定分離條件，使待測組分能完全分離，且該色譜條件中流動相不應(yīng)含有不揮發(fā)性鹽，如磷酸鹽。（三）、操作步驟 實施檢測操作的人員，必須熟悉該儀器的操作規(guī)程，儀器的工作狀態(tài)、包括檢測靈敏度和分辨率，必須滿足檢測項目的要求。1、開機前準(zhǔn)備 開機前應(yīng)檢查儀器室內(nèi)電、氣的供應(yīng)情況及空調(diào)機的工作狀態(tài)是否穩(wěn)定，檢查真空機械泵泵油是否需要更換。只有當(dāng) UPS工作正常，Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的壓力分別穩(wěn)定在0.35、0.35和0.7Mpa，環(huán)境溫度為10~30℃，相對濕度小于70%時才能開機。2、開機1）打開真空機械泵上的電源開關(guān)。 2）真空機械泵繼續(xù)工作至少15分鐘后，打開MS電源主開關(guān)。 3）等真空度達(dá)到2x10-5Torr（綠色指示燈不閃）后，打開 PC計算機電源3、儀器調(diào)諧（四）、方法建立.在Analyst軟件Tools菜單中選擇Project—CreateProjeq在Projectname項下輸入新建的Project名稱。注意，不要點選窗口中的其他按鈕！點擊 OK，確認(rèn)新建Projecto.在Analyst軟件界面下，雙擊導(dǎo)航欄內(nèi) HardwareConfiguration。在彈出窗口中選擇MassOnly,點擊ActivateProfile，激活MassOnly（只聯(lián)接質(zhì)譜主機）。.在導(dǎo)航欄內(nèi)單擊TuneandCalibrate，進(jìn)入調(diào)諧模式。點擊上方工具條中的 T鈕。此時，應(yīng)注意到主機有峙卜”聲音，表明進(jìn)入調(diào)諧狀態(tài)。此時右下角質(zhì)譜狀態(tài)顯示綠色。雙擊 ManualTuning，進(jìn)入質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置及運行窗口。.使用1mL玻璃進(jìn)樣針吸取適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于進(jìn)樣針座上。點擊 MSMethod下拉菜單，選擇SyringePumpMethod，設(shè)定針泵流速FlowRate為10〃L/min。.點擊StartSyringePump按鈕開針泵進(jìn)樣。.返回MSMethod，選擇掃描模式ScanType為Q1MS，設(shè)定掃描速度ScanRate為10Da/s,設(shè)定掃描范圍Start——Stop設(shè)定為50——化合物分子量。DP預(yù)輸入60。專業(yè)資料整理WORD完美格式編輯.點擊start開始采集數(shù)據(jù)。運行穩(wěn)定后，注意觀察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn)，并控制其響應(yīng)值在約E4以下。點擊stop，選擇第一個峰（后面是同位素峰）的平穩(wěn)段，雙擊，選中母離子。點擊右鍵，選擇DeletePane。.設(shè)定Scantype為產(chǎn)物離子掃描ProductIon（Ms2），掃描速度200Da/s，選擇掃描正/負(fù)離子，輸入母離子（productof），設(shè)定掃描范圍start——stop為50——MW+20，覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍，點擊compoud標(biāo)簽，設(shè)定（DP）60，（CE）5。.點擊start，開始采集數(shù)據(jù)，注意觀察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn)。 手動調(diào)節(jié)CE，以5eV為步長，逐漸增加。每次增加后稍作等待，直至目標(biāo)化合物的子離子清晰看見。選擇平穩(wěn)的一段，雙擊，選擇子離子。.選擇ScanType為MRM。設(shè)定參數(shù)表格中的Q1對應(yīng)的母離子，Q3對應(yīng)的子離子，time（ms）為50，ID值設(shè)為名稱1（定量），名稱2（定性）。.點擊EditRamp，在Parameter下選擇CollisionEnergy，點擊OK。點擊start開始采集數(shù)據(jù)，記錄每個MRM通道的最佳CE電壓。在MRM參數(shù)設(shè)定表中，右鍵點擊。選擇CollisionEnergyCE，調(diào)出表格中的CE歹上輸入每個MRM通道的最佳CE電壓值，精確到個位數(shù)。重復(fù)以上步驟，在Parameter項下選擇DeclusteringPotential，優(yōu)化并保存DP。完成后選擇菜單File/Save保存采樣方法，［文件名］.dam。（五）LCMS方法的建立：連接儀器：打開HPLC質(zhì)譜電源，將HPLC系統(tǒng)接上柱子，將6號出口管線與離子源連好。調(diào)離子源噴霧針位置到 2mm處，雙擊HardwareConfigure，在硬件配置菜單下單擊 LCMS（液相與質(zhì)譜聯(lián)用），單擊Activateprofile激活儀器，會聽到笛的一聲，說明儀器已經(jīng)連接上。確認(rèn)液質(zhì)同步：選擇項目（之前優(yōu)化方法的時候已經(jīng)建立的項目） ；雙擊Buildacquisitionmethod新建方法，彈出新建方法模板。在模板左側(cè)點擊 acquisitionmethod，模板右邊顯示對應(yīng)的參數(shù)，確認(rèn)synchronizationmode選擇LCSync,表示液質(zhì)同步。設(shè)置MRM參數(shù)：點擊方法模板左側(cè)的MRM,在模板右側(cè)ScanType下選擇MRM；在polarity下選擇化合物極性： Positive（正離子卜Negative（負(fù)離子）；Duration為15min（與液相分離相同的時間）；表格中Q1：母離子分子量， Q3（Da）:子離子分子量，Time（msec）：50，ID欄：化合物名稱（離子對名稱后空格加 1為定量，空格加2為定性），在表格中右鍵分別單擊 DP、CE，點擊工具欄的OPEN打開之前優(yōu)化的方法參數(shù)，調(diào)出 DP,CE值，選中整行，Ctrl+c（復(fù)制）參數(shù)，關(guān)閉窗口，再Ctrl+v（粘貼）參數(shù)）；最后點擊Editparameter設(shè)置離子源參數(shù)：Source/Gas項用以下推薦值：CUR35，IS:5500（正離子）或-4500（負(fù)離子），TEM600，GS160，GS270，點擊OK。專業(yè)資料整理WORD完美格式編輯4、設(shè)置液相參數(shù)：點擊模板左邊的shimadzuLCsystem,①在右邊的pumps欄下，設(shè)置stoptime（運行時間）為15min，flow流速為1mL/min，A為水相設(shè)為95%，B為有機相設(shè)為5%（設(shè)置時改B，A自動），泵最大壓力為50；點擊timeprogram設(shè)置液相梯度：例咪唑類梯度設(shè)置：Time(min)AB—95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%②接著在右邊的Autosampler欄下，設(shè)置清洗時間，在Rinsemode下選擇Beforeandafter（前后都洗），并設(shè)置清洗時間為5s，清洗液用50%甲醇水。最后點擊保存按鈕，在保存窗口輸入該方法的名稱。（五）數(shù)據(jù)處理雙擊打開Multiquilt，選擇項目，點擊File下的熒光棒型圖標(biāo)，點擊 sample，選擇需要的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)據(jù)，點擊next，createnewmethod，為方法命名，點擊next，選擇一個有代表性的樣品（一般選擇濃度較大的標(biāo)品數(shù)據(jù)），設(shè)置分組（同一物質(zhì)定量離子和定性離子設(shè)置為一組） ，并指定內(nèi)標(biāo)，next，對每個物質(zhì)進(jìn)行積分。設(shè)置積分參數(shù)：CausianSmoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；ExpecetedTime（保留時間）：一般不動Expectedtime范圍：一般30s，表示在保留時間±15s范圍最小峰寬最小峰高背景噪音扣除：可調(diào)整目標(biāo)峰基線以下被積分的面積，比例越高積分越往下，必要時調(diào)整。分峰因子：峰有分叉時設(shè)置，如有兩個分叉，設(shè)置為2，峰分叉不能大于2單位：設(shè)置單位，勾選Applyunitstoall可將此單位用于所有化合物點擊next，點擊finish。在新跳出窗口內(nèi)將標(biāo)準(zhǔn)品選定， 輸入濃度。查看各化合物積分是否正常，點擊第三個圖標(biāo)查看標(biāo)準(zhǔn)曲線。專業(yè)資料整理WORD完美格式輯實驗 利用液相色譜質(zhì)用速測水果中 7種農(nóng)的殘留量1實目勺：讓生了解利用液相色質(zhì)測定食盅梯農(nóng)殘留等有害化合物的分析流程。利用前2節(jié)所內(nèi)容際處樣，增學(xué)生踐能力。進(jìn)步加液相色譜譜操作和數(shù)據(jù)處。2試材料除非另有明，使用分析試劑水為B/T6682冊的二級。乙口電2H3N）：色譜氯鈉NaCl）：140℃干燥4h。氨基固相萃取小柱：500mg/6mL（或性能相當(dāng)?shù)钠渌滔噍腿≈?）。二氯烷甲醇混合液：二氯解醇（體比）=95+5。準(zhǔn)品：表1。霾準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)備鍛分準(zhǔn)確稱取一定量（精確至 0.1mg）農(nóng)標(biāo)品，用甲醇溶解，逐一配成1000mg/L的單一霾準(zhǔn)備液密封建在 -18℃冰箱中，使用期的個月。表19種農(nóng)準(zhǔn)品農(nóng)藥稱度（%）多菌靈>98吡蟲啉>98蟲98辛硫磷' >98網(wǎng)菌素>98克日威>98嘧霉女' >98混合農(nóng)標(biāo)溶液分準(zhǔn)確吸取一定體的 9種藥標(biāo)儲液（4.8.1）注入同一容量瓶中，用甲醇稀釋刻度配制成100mg/L的混合標(biāo)儲夜-18℃冰箱中密封閉保存，使用期兩個月?；旌蠘?biāo)工作液專業(yè)整理WORD完美格式編輯吸取一定體積的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯于 4℃以下冰箱中，需現(xiàn)用現(xiàn)配。3儀器設(shè)備電子天平：感量0.01g；破壁食物料理機：不低于20000r/min；均質(zhì)機：不低于20000r/min；恒溫水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀。4試驗步驟樣品制備鮮人參取不少于500g水果于破壁食物料理機中，以不低于 20000r/min的轉(zhuǎn)速將樣品制成糊漿狀，充分混勻后裝入樣品密封盒中直接測定或 -18℃保存，備用。樣品預(yù)處理提取稱取25g水果樣品（水果品種當(dāng)季待定），精確至0.01g，于100mL具塞離心管中，加入50mL乙腈，于勻質(zhì)機中高速勻質(zhì)1min，過濾至裝有7g氯化鈉的比色管中，振蕩 200下，靜止分層，吸取10mL上層有機相于50mL濃縮管中，60℃水浴中氮氣吹至近干，用2mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解殘渣，待凈化。凈化氨基柱用5mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解進(jìn)行預(yù)處理，當(dāng)溶劑液面達(dá)上層篩板表面時，再倒入上述濃縮管中待凈化溶液，用濃縮瓶接收，待液面下降至上層篩板表面，用 8mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解分2次沖洗濃縮管并洗脫小柱，將濃縮瓶中洗脫液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至盡干，氮氣吹干后用2.5mL甲醇和2.5mL水定容，過0.22m濾膜待測。儀器參考條件液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Qtrap4500三重四級桿/離子阱質(zhì)譜儀（配島津30A超高效液相色譜儀），電噴霧離子源，美國ABSCIEX公司。色譜柱：KinetexXB-C18,2.1mmx150mmx2.6師流動相及流速見表1色譜柱箱溫度：40℃進(jìn)樣體積：5.0比專業(yè)資料整理

WORD完美格式輯表1流動梯度及流速步驟/min流速/(l/min)0.1%甲酸水溶液/（%）甲醇//%）10.