生化課件中文翻譯

第五章和組研究技從caterpillar發(fā)展成蝴蝶，表達(dá)譜發(fā)生了一系列顯著變化。用DNA能同時檢測成自從1970年代出現(xiàn)DNA重組技術(shù)以來重組DNA技術(shù)給生物化學(xué)帶來了性進(jìn)步。生物的遺傳特征能夠根據(jù)人類設(shè)計加以改造。重組DNA技術(shù)是人類對DNA，RNA，DNA分子特異斷裂成易于操作的DNA片段；DNA連接酶能夠?qū)NA片段連接?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多限制性內(nèi)切酶。采用這種技術(shù)，研究人員能夠DNA片段從一個DNA分子轉(zhuǎn)移到另一DNADNA技術(shù)的基礎(chǔ)是核DNARNADNA技術(shù)中，堿基配對用于重組DNA構(gòu)建、檢測和擴(kuò)增特異核酸序列。重組DNA技術(shù)也依賴。能有效DNA整合到宿主組中質(zhì)粒是細(xì)菌外的遺傳物質(zhì)這種遺傳物質(zhì)對重組DNA技第三，已經(jīng)建立了非常有效的DNA序列測定技術(shù)。這些技術(shù)能夠測定全組序列。最先測定的是組，隨后是更長的細(xì)菌組，最后測定的是真核組，包括30蛋白質(zhì)的功能。重組DNA技術(shù)能夠制造臨有用的蛋白質(zhì)，如激素；也能用來制造耐受病蟲害或惡劣生長環(huán)境的農(nóng)作物。重組DNA技術(shù)提供的這些機(jī)會將產(chǎn)生更大的影響。5.1研究的關(guān)鍵工DNA片段。印跡技術(shù)。Southernblots和NorthernblotsDNARNA。面介紹的Westernblots采用抗體鑒定蛋白質(zhì)。DNADNA分子的堿基序列。DNA序列測定產(chǎn)生了大量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCRDNA片段擴(kuò)增上十億倍。PCR反應(yīng)能夠?qū)⒁粋€DNA分子擴(kuò)增到足以進(jìn)行DNA鑒定和操作的產(chǎn)量。該技術(shù)用于病原體鑒定和遺傳病息（尤其是DNA序列信息）進(jìn)行分類、檢索、和鑒定。而這些信息就是用前面提到的限制性內(nèi)切酶能夠?qū)NADNA的特定堿基序列并在特定位點(diǎn)斷裂DNA雙鏈。這種精確的分子手術(shù)刀是大自然饋贈給生物化學(xué)工作者的。分析結(jié)構(gòu)、測定非常長的DNA序列、分離、制造能被克隆的DNA分子都離不開限制性內(nèi)切不同原核生物都有限制性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的生物功能是斷裂外源DNA由于限制酶識別位點(diǎn)的堿基序列已被甲基化，因此限制酶不斷裂生物自身的DNA分子。很多限制酶識別的核酸序列長度是4~8個堿基對，這個區(qū)域兩條核酸鏈都會被這個核酸內(nèi)切Streptomycesachromogenes的限制性內(nèi)切酶識別的核苷酸序列是這個酶水解對稱軸兩側(cè)的C-G磷酸二酯鍵。在第9章所介紹的內(nèi)容，限制性核酸（EcoEsterichiacoliHinaegyptius5.1一些限制性內(nèi)切酶的特異性。這些酶識別序列有二重對稱軸。圍繞該對稱軸（綠色限制性內(nèi)切酶能夠?qū)NA分子斷裂成易于進(jìn)行分析和的特異片段。例如長度11HindIII切點(diǎn)。一個限制性內(nèi)切酶酶切DNA的產(chǎn)物可以用另一個限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生更小的DNA片段。DNADNA片段圖譜可以作為該DNA分子的。實(shí)際上，用一些列限制型內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的限制型內(nèi)切酶圖譜可以DNADNA分子間的凝膠孔徑更大，分子范圍達(dá)到20kb。這些凝膠電泳的一個典型特征是分辨率高有些凝膠電DNADNA片段。而且長DNADNA分子。當(dāng)5.2ng的DNA量就足以用溴化乙錠顯色觀察。圖5.2限制性核酸內(nèi)切酶酶切SV40DNA分子的凝膠電泳圖譜。每孔相應(yīng)于一種核酸內(nèi)切酶。DNA片段用溴化乙錠染色顯示出熒光。 DNASouthernblot分析顯示的DNA硝酸纖維素膜置于32P-標(biāo)記的DNA探針溶液雜交，探針能夠結(jié)合與探針序列互補(bǔ)的DNA片段，放射性自顯影能夠顯示這條DNA片段所在的位置。這種方式能夠從成千上萬DNADNA片段（就像大海撈針EdwinSouthern設(shè)計的，因此成這種檢測技術(shù)是Southernblotting(印跡)。5.3SouthernBlotting.DNA32P-DNA探針（序列與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)）DNA異抗體檢測特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。Southern,Northern,Westernblots也稱為DNA,RNA，和Proteinblots.選擇性終止能測定DNA序DNA序列測定技術(shù)也極大地促進(jìn)了DNA結(jié)構(gòu)和功能的研究。DNA序列測定的關(guān)鍵是產(chǎn)生一組DNA片段，其長度取決于DNA序列最后一個核苷酸。FrederickSanger及其同事建立了Sanger雙脫氧方法（即選擇性終止）測定DNA序列的技術(shù)。與其他技術(shù)相比，Sanger雙脫氧法簡便，能夠同時進(jìn)行四種終止反應(yīng)。在這些混合物中，DNA聚合酶用來制DNA單鏈模板的互補(bǔ)DNADNA片段，與模板分子的序列種2',3'-雙脫氧核苷三磷酸類似物，各個混合物所含的類似物不同。5.4DNA序列的策略。2'3'-DNA聚合酶促反DNA3'-2'3'-ddATP(紅色）產(chǎn)生的DNA片段，其末端都是ddA。由于缺乏3'-OH，這種鏈不能繼續(xù)延伸。DNADNA聚ddATPDNA3'-ddA(5.4。ddA參與的位點(diǎn)就是待這樣每種鏈終止反應(yīng)就帶有一種特異的熒光（例如藍(lán)色熒光表示ddA,紅色熒光表示孔中進(jìn)行凝膠電泳分離。條帶泳動的先后次序表示DNA鏈的長度，條帶的熒光顏色表示5.5550DNA序列。熒光檢測更好，這種方法不用放射性同位素，易于自動化檢測。實(shí)際上，現(xiàn)代DNA儀器采用這種方法每天能夠測定的DNA序列超過100萬堿基。圖5.5熒光檢測雙脫氧法產(chǎn)生的寡核酸片段。四個鏈終止雙脫氧核苷酸用不同顏色的熒光標(biāo)記（如紅色標(biāo)記T。色譜圖中一種顏色表示一種核苷酸。固相自動法能合成DNADNA鏈?；罨瘑误w5.6（五價磷5'-OH的保護(hù)基團(tuán)DMT，但不影響其它保護(hù)基團(tuán)?，F(xiàn)在DNA合成已經(jīng)完成一個核苷酸延長，可以進(jìn)行下一作。每延長一個核苷酸耗時10分鐘，延伸效率超過99%。5.6DNA鏈。3'-亞磷酰胺，5'-OH用DMT保護(hù)，3'-磷氧原子用CE相方法是化學(xué)合成DNA、多肽的理想途徑。所有反應(yīng)都在一個反應(yīng)器中進(jìn)行，可以加入過水處理能夠釋放合成的寡核苷酸，并除去所有的保護(hù)基團(tuán)。由于延伸反應(yīng)過100%，HPLC100核苷酸的DNA鏈。DNA鏈?zhǔn)刮覀兡軌蜷_展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端用32P或熒光基團(tuán)標(biāo)記可以用來搜尋很長DNA分子或含有很多的組中某段互補(bǔ)的DNA序列，用標(biāo)記寡核苷酸作為探針使用很有效，也很普及。例如，能夠與體上某段序列互補(bǔ)的DNA探針可以用來探討上相鄰DNA。用該探針作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增能獲得相鄰的DNA片段。DNA化學(xué)合成技術(shù)能夠制造新。已經(jīng)有很多實(shí)例利用合1984年KaryMullis設(shè)計了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特意的DNA序列。DNA分子DNADNA序列（即目標(biāo)序列）DNA序列。如果目標(biāo)序列兩側(cè)的DNA序列已知就能用PCR擴(kuò)增制造大量的目標(biāo)序列。在含有目標(biāo)序（1（2）熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。一輪PCR反應(yīng)含有三個步驟（圖5.7鏈分離。將DNA9515sDNADNA引物雜交。將DNA54℃，使引物與DNA鏈雜交。一種引物與其中一物量比親本DNA多很多，因此不會形成親本DNA雙鏈。thumusaquaticus分離的。兩條引物發(fā)生延伸（5'-3')。兩條引5.7PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)含有三個步驟：鏈分離，引物雜交，和引物延伸（DNA合成。PCR擴(kuò)增。改變混合物的溫度恩能夠重復(fù)上述操作。DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是PCR反應(yīng)在一支密閉試管內(nèi)執(zhí)行PCR操5.8一些短鏈（由目標(biāo)序列和兩側(cè)引物序列構(gòu)成）nPCR擴(kuò)到數(shù)十億數(shù)量級。這些擴(kuò)增可以在1小時內(nèi)完成。圖5.8PCR反應(yīng)。第三輪擴(kuò)增的產(chǎn)物是兩分子的短DNA雙鏈（相伴產(chǎn)生的兩分子的DNA雙鏈沒有畫出DNAPCR列，而親本DNADNAR10kb第三引物與側(cè)序列不必要10%對用序列已設(shè)的引物R能夠檢測異，發(fā)。第四提高雜溫能夠提高R擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)性。謹(jǐn)性（DNAR技術(shù)能夠擴(kuò)增高等生的某一，雖該總DA的量還不到萬分之。R能夠擴(kuò)檢測單NAPCR能夠提供有價值的醫(yī)學(xué)診斷結(jié)果。用特異引物進(jìn)行PCR能夠檢測細(xì)菌和。例特定區(qū)域的DNA序列在檢測治療效果方面也有用。如果PCR檢測結(jié)果顯示癌細(xì)胞已被消除，化療就可以停止。PCR檢測發(fā)現(xiàn)停藥后癌細(xì)胞又出現(xiàn)了，就要恢復(fù)用藥。PCR檢，在法醫(yī)領(lǐng)域PCR也非常有用。在人群中很多遺傳是高度可變的，因此這些為點(diǎn)的DNA譜有專一性。例如人白細(xì)胞表面抗原(HLA)就是高度可變的，PCR能夠確定的HLA類型。若供體和受體的HLA類型不匹配移植后悔產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。多，5.9DNADNA分子就更為穩(wěn)定。在這樣的條件下，大的DNA分子在幾千年的時間內(nèi)不發(fā)生斷裂。PCR是擴(kuò)增古代DNA分子的理想方法。擴(kuò)增之后才能進(jìn)行鑒定和檢測。PCR還能擴(kuò)增那些無法培養(yǎng)微生物的DNA。下一章將介紹PCR產(chǎn)物的DNA序列能夠不同生物的進(jìn)化關(guān)系。5.9DNA與法醫(yī)。DNAPCR擴(kuò)增，與嫌疑人和受DNA樣品進(jìn)行比較，凝膠電泳后放射性自顯影。嫌疑人衣服上的血跡DNA與受害人一致，但與嫌疑人不同。DNA330億分之一，因此用這種技術(shù)鑒定的結(jié)果非常準(zhǔn)確。上樣孔分別是：，1kb，TS（DNAD（DNA),ns和shirt（來自嫌疑人衣物的血跡，V（受害者DNA).1970PaulBerg,HerbertBoyer,StanleyCohen技術(shù)，使生物學(xué)從純粹的分析科學(xué)發(fā)展成合成科學(xué)。采用重組DNA技術(shù)，再能夠?qū)⑺拗鱀NA合成機(jī)器能合成引入的組合。宿主細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)錄外源，并翻譯合成外DNA連接酶是形成重組DNA現(xiàn)在我們介紹如何構(gòu)建新DNA分子。目標(biāo)DNA片斷必須與DNA載體共價交（vector如，質(zhì)粒pSC101是一個9.9-kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子，有一個單一切點(diǎn)EcoRI。用EcoRIDNAEcoRI酶切產(chǎn)生的粘性末端相同（用相同的限制性內(nèi)切酶斷裂大DNA分子能夠獲得）就能與載體結(jié)合（圖5.10DNA片段末端的單鏈區(qū)與質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生末端的單鏈區(qū)互補(bǔ)，退火配對后用DNA連DNA分子是雙鏈，連接反應(yīng)需要ATP或NAD+提供能量。5.10粘性末端將DNA分子結(jié)合DNADNADNA與平端的DNA5'-末端磷酸化，然后用5.11DNA分子都可以用這種方法制造粘性末端。將化學(xué)合成和酶學(xué)方法結(jié)合制造新DNA分子。5.11質(zhì)粒和噬菌體是在大腸桿菌進(jìn)行DNA克隆的選擇性載體DNA分子進(jìn)入細(xì)菌或易粒是細(xì)菌不可或缺的。每個細(xì)菌可以完全沒有質(zhì)粒，也可以有20拷貝的質(zhì)粒。pBR322質(zhì)粒.第一個用于克隆的質(zhì)粒是pBR322。這個質(zhì)粒有兩個抗生素分DNAEcoRIDNA片段不影響質(zhì)粒的兩種抗生素抗性。在SalI或BamHI位點(diǎn)插入外源DNA導(dǎo)致四環(huán)素抗5.12BamHI位點(diǎn)插入外源DNApBR322能夠耐受氨芐抗生素，但不能耐受四環(huán)素，因此可以圖5.12質(zhì)粒pBR322的遺傳圖譜。該質(zhì)粒攜帶兩個抗生素抗性。與其它質(zhì)粒一樣，該質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA分子。pUC18質(zhì)粒。與pBR322質(zhì)粒相比，更新的質(zhì)粒載體已經(jīng)被改造使之易于使用。pUC18就是這類質(zhì)粒的代表（圖5.13。與pBR322一樣，該質(zhì)粒有一個起點(diǎn)，有一個氨芐青能夠降解一些糖。因此能夠?qū)o色底物x-Gal轉(zhuǎn)化成可見的藍(lán)色產(chǎn)物。通過工程的方法增加了質(zhì)粒適應(yīng)各種末端DNA插入的能力。DNA片段的插入導(dǎo)致半乳糖苷酶失活，不能產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。因此利用顏色能夠鑒定攜帶重組DNA的大腸桿菌細(xì)胞。圖5.13質(zhì)粒pUC18的遺傳圖譜。該質(zhì)粒的半乳糖苷酶（也稱為lacZ）有多接頭序列（polylinker。DNA片段插入該區(qū)域的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)導(dǎo)致半乳糖苷酶失活。噬菌體。另一個廣泛使用的載體是噬菌體。5.14合成DNA和蛋白質(zhì)包裝成顆粒導(dǎo)致宿主細(xì)胞每個細(xì)胞能夠釋放100個字代顆粒。在溶原途經(jīng)，噬菌體DNA插入宿主，隨宿主一道，病導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。噬菌體組有48kb，但不是所有的組DNA都是噬菌體必需的。那些噬菌體不必需的DNA區(qū)域是可以用其它DNA替換的，因此噬菌體是一種理想圖5.14噬菌體不同的模式。噬菌體細(xì)菌后，要么采用溶菌生長，要么采用溶原5.15因組中間區(qū)域刪除，剩余的兩側(cè)DNA片段（稱為左臂和右臂）的長度相當(dāng)于原始噬菌體組長度的72%。噬菌體包裝要求DNA長度相當(dāng)于正常噬菌體組長度的75%~105%，因此沒有DNA片段插入的左臂和右臂DNA連接就無法被包裝成顆粒。只有那些插入適當(dāng)長度的DNA片段才能被包裝成噬菌體顆粒。用噬菌體作為載體的另隆的噬菌體載體。將噬菌體和質(zhì)粒雜合而成的工程載體cosmid能夠插入長度達(dá)到45kb的DNA片段。圖5.15突變的噬菌體充當(dāng)克隆載體。包裝選擇的DNA分子含有插入DNA片段是工程改造的大腸桿菌F因子，能夠插入長度達(dá)到300kb的DNA片段。YACs有著絲（cenrimere（ARS5.16長度達(dá)到1000kb的DNA也可以克隆到Y(jié)AC載體中。圖5.16酵母人工（YAC）圖譜。載體含有在酵母細(xì)胞內(nèi)和穩(wěn)定DNA的元件DNA從長度超過3x106kb的組中分離一個長度只有幾kb的DNA片段需要明智的克隆和篩選方案例如人組有一個單拷貝需要克隆我們就要制造一個DNA片段文庫，片段（圖5.17。該過程產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量大，性近乎隨機(jī)。然后用凝膠電泳分15kbDNADNA片段是用機(jī)械方法制造的，DNA片段末端重組的噬菌體顆粒，攜帶的DNA片段涵蓋全部的人DNA。這些噬菌體構(gòu)成組文庫（genomiclibrary。噬菌體可以無限傳代，因此組文庫也可以反復(fù)使用。15kb99%50萬克隆。沒有迅速有效的篩選技術(shù)，完成這個工作時不可能的。DNA雜交是一種快速篩選方法。（5.18DNADNA32P-DNARNA探針雜交。如果夠確定攜帶重組DNA的重組噬菌置。從原來的細(xì)菌生長平板（主板）挑出相應(yīng)的噬菌斑，進(jìn)一步培養(yǎng)。一個科研人員用這種技術(shù)一天能夠篩選100萬克隆。圖5.17組文庫的制造。全組消化后，用來制造組文庫圖5.18從組文庫篩選某一特定。此圖表示從圖5.17制造的文庫篩選含有a基某一mRNA含量豐富的細(xì)胞開始，分離該的mRNA。例如紅細(xì)胞含有豐富的血紅蛋白mRNAmRNAmRNA進(jìn)一步按大小分5.19從蛋白質(zhì)序列設(shè)計探針。根據(jù)氨基酸序列推測相應(yīng)的編碼核酸序列，化學(xué)合成編碼該段多肽序列的所有寡核苷酸。由于遺傳的簡并性，這個七肽有256種可能的編碼序5.196個遺傳子固相合成編碼這種多肽的所有核酸序列（或者互補(bǔ)的核酸序列32P標(biāo)記寡核苷酸的5'-末端。將硝酸纖維素膜置于含有這些探針的溶液中浸泡，放射性自顯影能夠確定直接改變DNA測定DNA序列而重組DNA技術(shù)是先在體外制造特定變異用三類直接變（缺失、（deletionsDNA雙鏈。這種策略能夠刪除較大的DNA片段。更小的缺失可以用限制性內(nèi)切酶在一個位點(diǎn)斷裂質(zhì)粒，然后用核酸外切酶處理刪除末端核苷酸。用DNA連接酶連接縮短的DNA鏈產(chǎn)生環(huán)狀DNA雙鏈，此時之刪除了這個限制性附近的很小區(qū)域。5.20cDNA的質(zhì)粒而且（2）我們也知道需要突變位點(diǎn)附近的核苷酸序列，就可以進(jìn)行寡核苷酸指導(dǎo)的定點(diǎn)突變。若這個位點(diǎn)的絲氨酸子是TCT，那么定點(diǎn)變異就將該子變成TGT(即只需將該子中間的C變成G就可以。寡核苷酸與這個區(qū)域的溫度條件下，不配對區(qū)域可以是1~15個核苷酸。配對后，用DNA聚合酶延伸，然后用插入：casstte突變。另一個有價值的方法是cassette突變。質(zhì)粒用一對限制性內(nèi)切酶酶切刪除一小段DNA，然后加入末端與限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物末端序列互補(bǔ)的DNA片段，連接。每個質(zhì)粒都含有所需變異（圖5.21設(shè)計。將自然界并沒有結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（)，用工程方法將相關(guān)的編碼DNA片段拼接起來制造新。例如將編碼抗體的與編碼毒素的拼接用重組DNA技術(shù)大量制造沒有性的外殼蛋白，作為的安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)的技術(shù)能夠合成全新，這種新能夠制造自然界根本不存在的蛋白質(zhì)（圖5.22圖5.22蛋白質(zhì)設(shè)計。化學(xué)方法合成全新。在有些情況下，合成所編碼的蛋白質(zhì)其前面介紹的方法能夠分離鑒定DNA片段但是從到人類各種生物的組DNADNADNA片段特異性排列是它們行使其功能的關(guān)鍵。有沒有可測定全組序列并分析全組？對于那些很小的組，DNA序列測定方法建Sanger測定第一個蛋白質(zhì)（胰島素)25年后，1977年16569bpDNA2個rRNAs,22tRNAs，13個蛋白質(zhì)。隨后又測定為最簡單的自由生長生物的組DNA含有100多萬堿基對。因此測定組全序列既要300~500堿基對的短片段組利用熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸，DNA序列測定實(shí)現(xiàn)了自動化。由此能夠迅速、高通量、自動測定DNA序列。1995年利用“shotgun”策略測定了Haemophilusinfluenzae的基因組全序列。測定隨機(jī)剪切組產(chǎn)生的各種DNA片段的核苷酸序列。用計算機(jī)程序，依靠片段組裝成組全序列。Haemophilusinfluenzae的組有 個蛋白質(zhì)(tu5.23)。采用類似的途徑科研人員已經(jīng)測定了100多種細(xì)菌和古生菌組的全序列包括一些關(guān)鍵的模式生物如E.coli,Salmonellatyphymurium,和Archaeoglobus,fulgidus,和致病菌如Yersinapestis(bubonic)和Bacillusanthracis(炭蛆anthrax)。）1996年測定出第一個真核生物（啤酒酵母Saccharomycescerevisiae組全序列。酵）多細(xì)胞真核生物是線蟲(Caenorhabditiselegans)的組全序列。線蟲組有9700萬堿基對，19000多個。廣泛用于生物學(xué)研究的其他生物的組也被測定，包括果蠅melanogaser，completed，finished（finishied圖5.23全組圖譜。Haemophilusinfluenzae的組是人類測定全序列的第一個自由生長生物的全組。該組編碼1700蛋白質(zhì)和70個RNA分子。與其它生物功能已知蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對確定了大約1/2數(shù)量的該組編碼蛋白的功能。測定、分析人組序列已經(jīng)成為組學(xué)研究的大多數(shù)目標(biāo)。人組有24種染色體，大約30億堿基對，確定這些的組全序列是相當(dāng)?shù)?。?jīng)過界和私人企業(yè)分工合作，2001年首先人組序列草圖。2004年晚期宣布人組全序列（finished（5.24圖5.24人類組。人組有46條，即22對常和X、Y性。圖中類組序列測定之初，人們估計人類組有10萬種蛋白質(zhì)編碼。在人類組序列測定完成之時（completed，人們估計人類組有3萬~3.5萬種蛋白質(zhì)編碼。在人類組全序列測定結(jié)束的時候（finished，人們估計人類全組只有2萬~2.5萬種蛋白質(zhì)編碼。本書采用2.5萬種編碼。估計數(shù)字降低的部分原因是人組有相當(dāng)關(guān)的組有一半以上的DNA是假。其它脊椎動物和嚙齒類動物與嗅覺有關(guān)的組人組的DNA不編碼蛋白質(zhì)。現(xiàn)化化學(xué)和遺傳學(xué)的重大任務(wù)之一就是闡明這些非編碼DNA的功能。這類DNA之所以存在于人組大多是由于DNA有移動 這些元件與與反轉(zhuǎn)錄有關(guān)大多數(shù)移動遺傳元件積累突變喪失功能人組中有100AluAlu300堿基。AluSINES(shortinterspersedelements,短的散落元件)。人組還有將近100萬種LINES(longinterspersedelements,（completon（completed白質(zhì)有99%在嚙齒類組中找得到。人類和嚙齒類在7500萬年前有共同的祖先，但是在隨后的進(jìn)化過程中這些在上的位置進(jìn)行了重新布局（圖5.25圖5.25組比較。人組和小鼠組比較顯示大片段發(fā)生重新布局為了進(jìn)行組比較，還側(cè)額定了其它生物的組序列。例如，已經(jīng)測定了兩種河因組只有4億堿基對，相當(dāng)于人類組的1/8.，但是河豚魚的數(shù)目與人的數(shù)目的1000多個人類。這兩種河豚魚在2500萬年前有共同的祖先。比較這兩種河豚魚的有兩拷貝。但是每個細(xì)胞中具體的表達(dá)水平（即mRNA含量）的差異很大，有的根本就沒有產(chǎn)生mRNA，有的在這個細(xì)胞內(nèi)有成百上千拷貝的mRNAs。例應(yīng)答導(dǎo)致的表達(dá)譜也有差異。注意，mRNA水平常常與相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平一致，但是mRNA（1）（2）5.265.2750%表達(dá)水平處于一個細(xì)胞含有0.1–1.0mRNA。這種技術(shù)能夠檢測各個在不同圖5.26用微陣列分析表達(dá)。DNA微陣列（即DNA）能夠同時分析成千上萬種的表達(dá)。此處采用的DNA針對1733種，分析84個樣本，顯示乳腺圖5.27檢測酵母表達(dá)水平的變化。微陣列分析顯示不同條件下酵母的表達(dá)水平可以精確真可以將真引細(xì)菌，核生物以作為標(biāo)白的生產(chǎn)廠。也以將NA入高等生的細(xì)胞內(nèi)引動物是究能的有用也治的基礎(chǔ)將基物。盡管真核給醫(yī)和農(nóng)業(yè)來效益但真核也是們爭論焦點(diǎn)。在宿主細(xì)胞能夠表達(dá)cDA哺乳DNA如何克隆到大腸桿菌病在大腸桿菌表達(dá)？大多數(shù)哺乳是外顯子和內(nèi)含子果細(xì)菌攝取的真核DNA只是與mRNA互補(bǔ)的序列，細(xì)菌就能夠表達(dá)真白質(zhì)。例如，細(xì)菌質(zhì)粒含有人胰島素前體mRNA的互補(bǔ)DNA序列，就能夠在細(xì)菌合成胰島素前體5.28合成cDNA的關(guān)鍵酶是反轉(zhuǎn)錄酶。前面，反轉(zhuǎn)錄酶是反轉(zhuǎn)錄在其組時合成RNA-DNA雜合子的酶。如果DNA引物與RNA組序列互補(bǔ)且具有3’-DNARNATmRNA3’-末5.29DNADNADNA。例如dGDNA3’oligo（dC）作為引物合成另一條DNA鏈。然后末端與合成的接頭連接，再插入適當(dāng)?shù)妮d體?？梢院铣梢粋€細(xì)胞所有mRNAs的cDNAs，并將這些cDNAs插入載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌制造cDNA文庫。圖5.28細(xì)菌合成前胰島素。前胰島素，即胰島素前體，可以用轉(zhuǎn)化大腸桿菌合成。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌含有哺乳動物的前胰島素cDNA。mRNA鏈，合成另一條DNA能夠在細(xì)菌表達(dá)真核cDNA分子的載體叫表達(dá)載體。為了實(shí)現(xiàn)表達(dá)的最大化，控制cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子是細(xì)菌的強(qiáng)啟動子、cDNA的插入必須維持正確的讀碼框架。為了保證mRNA的有效翻譯，在mRNA起始子上游有一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)。cDNA克5.30圖5.30篩選cDNA克隆。用針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合篩選能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白的cDNA克隆。DNA有幾種方式能夠?qū)⒅亟MDNA分子引入哺乳細(xì)胞。式是用動物細(xì)胞攝取磷酸鈣沉效率低，但是操作容易。另案是將DNA顯微注射到動物細(xì)胞。含有外源DNA溶液5.31時內(nèi)能夠顯微注射幾百個卵。約2%的注射鼠細(xì)胞存活，含有外源DNA。第三種方法用將外源引入。最有效的載體是反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄要經(jīng)過DNA,因此遺傳信息流動與標(biāo)準(zhǔn)的流動方式相反。反轉(zhuǎn)錄生活周期的顯著特征是反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的DNA雙鏈會整合到宿主DNA中，與正常DNA一道。反轉(zhuǎn)錄通常不會殺死宿主細(xì)胞。用Moloneymurineleukemia作為載體，能夠接受長度達(dá)6kb的外源DNA，并有效地將外源DNA引入哺乳細(xì)胞。有些插入的位置能夠有效地表圖5.31顯微注射DNA?？寺〉馁|(zhì)粒DNA正在顯微注射到小鼠卵的雄性核中。另外兩種也是用廣泛。牛痘（Vaccinia）和桿狀(Baculo)。牛痘時一個大DNA，在哺乳動物細(xì)胞質(zhì)，停止宿主蛋白質(zhì)合成。桿狀昆蟲細(xì)胞，而昆蟲細(xì)胞可以用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)昆蟲的昆蟲蛹能有效地合成外源編碼的。遺傳工程制造的巨鼠能解釋外源在哺乳細(xì)胞的表達(dá)（圖5.32。將大鼠生長激素基因引入小鼠卵生長激素(growthhormone,somatotropin)是腦垂體(pituitarygland)（dwarfism物生長成巨人癥（gigantism。大鼠生長激素插入一種質(zhì)粒，位于小鼠金屬硫蛋白5.33圖5.32轉(zhuǎn)鼠。將生長激素注入小鼠卵，產(chǎn)生巨鼠（左邊其體重相當(dāng)于同圖5.33大鼠生長激素-金屬硫蛋白構(gòu)造。大鼠生長激素（黃色）插入一種質(zhì)Southernblots顯示顯微注射胚胎發(fā)育生成的小鼠含有大鼠生長激素。每個細(xì)胞含有約30拷貝的大鼠生長激素的小鼠比對照小鼠生長快得多。飲用水有金屬鎘時，轉(zhuǎn)小鼠體內(nèi)的生長激素水平是對照小鼠生長激素水平的500倍。成轉(zhuǎn)小鼠體重相當(dāng)于對照小鼠體重的2倍。在轉(zhuǎn)小鼠體能夠轉(zhuǎn)錄外源DNA，賓且能夠?qū)?個內(nèi)含子序列從轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中刪除形成有功能的mRNADNAknockout這些方法取決于同源重組。重組就是序列類似的DNA區(qū)域發(fā)生交換。外源DNA插入破壞的宿主，其宿主至少有部分與外源DNA發(fā)生了同源DNA交換（圖5.34圖5.34同源重組破壞（A）構(gòu)建一種突變但維持了正常的一些區(qū)（紅色）5.35合子小鼠含有一拷貝野生型myogenin和一拷貝突變，表型正常，提示表達(dá)組織切片。兩拷貝myogenin均遭破壞的小鼠，肌肉不能正常發(fā)育。在研究RNA引入細(xì)胞的過程中，無意間發(fā)現(xiàn)了一種極為有效的破壞表達(dá)的工具。RNARNAmRNA。因此，引入特定RNA能夠干擾特定的表達(dá)。5.3621RNARNA19bpRNA5’-RISC(RNA-directedsilencingcomplexRISCRNA那些與該RNAmRNARNA5.36RNA雙鏈RNA分子被Dicer21-bpsiRNA。這些RNA整合到RISC后，指導(dǎo)RISC斷裂序列與siRNA互補(bǔ)的mRNA。RNARNARNARNARNA但是RNA干擾時降低特意表達(dá)水平的一個有效工具。而且RNA干擾的臨床試驗(yàn)正在普通的土壤細(xì)菌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）植物能夠?qū)⑼庠碊NA導(dǎo)入植物細(xì)胞（圖5.37。腫瘤組織的隆塊叫(crowngall)在位置生長，合成變，以滿足者特異的營養(yǎng)要求。A.tumefaciens攜帶的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒Ti攜帶指令，使細(xì)胞進(jìn)入腫瘤狀態(tài)合成opines。Ti質(zhì)粒DNA的少部分遺傳物質(zhì)整合到植物細(xì)胞的基因組；這段長度達(dá)到20-kb的DNA稱為T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA;圖5.38)。圖5.38Ti質(zhì)粒。含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能夠?qū)⑼庠催f送給一些植物細(xì)胞Ti質(zhì)粒的衍生物可以用來加工外源DNA遞送到植物細(xì)胞。首先采用限制性內(nèi)切酶和DNADNAT-DNATi農(nóng)桿菌細(xì)胞發(fā)生DNA重組形成含有外源的Ti質(zhì)粒這些Ti質(zhì)粒在改造農(nóng)作物品質(zhì)、改進(jìn)農(nóng)作物產(chǎn)量方面大有用武之地。但是有些植物不能用Ti質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移。所有雙子葉植物和少量葉植物可以用Ti轉(zhuǎn)移外源，但是經(jīng)濟(jì)上重要的葉