病毒與亞病毒

病毒與亞病毒第1頁/共43頁第三章病毒與亞病毒第一節(jié)病毒的性質(zhì)第二節(jié)病毒的研究方法第三節(jié)病毒復(fù)制第四節(jié)病毒的非增殖性感染第五節(jié)亞病毒第六節(jié)病毒的可利用價(jià)值第2頁/共43頁第一節(jié)病毒的性質(zhì)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)二、病毒的化學(xué)組成三、病毒的理化抗性第3頁/共43頁一、形態(tài)結(jié)構(gòu)1.形態(tài)和大小形態(tài)多樣,100nm以下。2.結(jié)構(gòu)：核(衣)殼+核酸或包膜（來源于核膜或細(xì)胞膜）。第4頁/共43頁衣殼對(duì)稱類型螺旋對(duì)稱二十面體對(duì)稱復(fù)合對(duì)稱第5頁/共43頁二、化學(xué)組成（一）病毒的核酸（DNA或RNA）1.正極性和負(fù)極性正極性(+RNA)：可作為mRNA。負(fù)極性(-RNA)：與其mRNA序列互補(bǔ)。雙意RNA：正極性+負(fù)極性。DNA：和mRNA互補(bǔ)→-DNA；和mRNA序列相似→+DNA。2.感染性核酸（infectiousnucleicacid）抽提分離的病毒核酸→導(dǎo)入細(xì)胞→產(chǎn)生子代毒粒。第6頁/共43頁（二）病毒的蛋白質(zhì)含量多（40-90%）；種類少（一種或幾種）。1.結(jié)構(gòu)蛋白如殼體蛋白、包膜蛋白，主要是保護(hù)、參與識(shí)別和吸附。2.功能蛋白如溶菌酶、轉(zhuǎn)錄酶等、主要參與侵入、釋放或復(fù)制。第7頁/共43頁（三）、脂類和糖類都來源于細(xì)胞；種類和含量同于宿主細(xì)胞（磷脂+膽固醇）;注：少數(shù)無包膜病毒（T系噬菌體、λ噬菌體等）也有脂類。第8頁/共43頁三、理化抗性1.溫度耐冷不耐熱，離體，56～60℃，30min→滅活。保存：低溫真空干燥法(-20～-196℃)；適量鹽溶液（MgCl2，MgSO4）可提高熱穩(wěn)定性。2.射線擊毀病毒核酸?；钚匀玖希ㄈ缂妆桨诽m、中性紅、丫啶橙）滲入并與核酸結(jié)合→可見光滅活。3.pH：5.0～9.0穩(wěn)定。第9頁/共43頁4.脂溶劑破壞包膜，如乙醚、氯彷→分類的依據(jù)。5.化學(xué)消毒劑對(duì)氧化劑（如高錳酸鉀、次氯酸鹽）敏感；酒精、酸堿、環(huán)氧乙烷可殺滅。

6.抗生素不敏感，但患病須注射。第10頁/共43頁第二節(jié)病毒的研究方法一、分離與純化二、效價(jià)測定第11頁/共43頁一、分離純化（一）分離1.標(biāo)本采集與除菌處理（1）采集：有足夠活病毒。如倒罐液，感染者血液、分泌物等。（2）除菌處理采用抗生素、離心、過濾等。第12頁/共43頁2.接種與感染表現(xiàn)（1）接種考慮宿主范圍、組織嗜性；操作簡單、易培養(yǎng)、易判斷。注：盲傳：第一次接種未出現(xiàn)癥狀，重復(fù)接種。目的：提高效價(jià)。盲傳二代后，仍未癥狀→無活病毒。第13頁/共43頁（2）感染表現(xiàn)噬菌斑、壞死斑（枯斑）、蝕斑（空斑）。①噬菌斑（plaque）噬菌體→平板培養(yǎng)物→圓形的透明區(qū)域。有一定的形態(tài)，用于分離、鑒定和計(jì)數(shù)。噬菌斑第14頁/共43頁②壞死斑（枯斑）植物病毒→敏感植物葉片→壞損區(qū)域。③蝕斑（空斑）動(dòng)物病毒→細(xì)胞單層上→病損區(qū)。細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生“致細(xì)胞病變效應(yīng)”（細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、融合成多核細(xì)胞，有包涵體或裂解）。第15頁/共43頁包涵體(inclusionbody)光鏡下可見、圓形、卵圓形或不定形的蛋白質(zhì)結(jié)晶。組成多為病毒顆粒或病毒亞基；少為細(xì)胞對(duì)感染的反應(yīng)產(chǎn)物，無病毒粒子。實(shí)踐應(yīng)用病毒診斷—大小、形態(tài)、數(shù)量、組成以及位置→快速鑒別→輔助診斷。

用于生物防治—昆蟲病毒→多角體（堿性蛋白）→殺蟲。第16頁/共43頁（二）、病毒的純化1.標(biāo)準(zhǔn)（1）保持感染性；（2）大小、形態(tài)、密度、組成及抗原性均一。2.方法鹽析、等電點(diǎn)沉淀、凝膠層析、離子交換等；超速離心第17頁/共43頁二、效價(jià)測定效價(jià)：指1mL培養(yǎng)液或試樣中病毒感染單位數(shù)目（噬菌斑形成單位數(shù)或感染中心數(shù)）。1.物理顆粒計(jì)數(shù)：電鏡。2.感染性測定：測噬菌斑、枯斑(須用石英砂摩擦葉片)和蝕斑數(shù)。第18頁/共43頁底層培養(yǎng)基2-4ml上層培養(yǎng)基0.2ml敏感菌懸液0.1ml噬菌體試樣上層培養(yǎng)液噬菌斑37℃，12h雙層平板法第19頁/共43頁第三節(jié)病毒復(fù)制一、病毒的增殖過程二、一步生長曲線

（one-stepgrowthcurve）第20頁/共43頁一、病毒的增殖過程（E.coliT4噬菌體）吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放。（一）吸附

1.特異性吸附蛋白（VAP）→→細(xì)胞受體（細(xì)胞生長必須）。

2.原理：空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，氫鍵、疏水性相互作用、范德華力。第21頁/共43頁（二）侵入1.噬菌體：注射。2.動(dòng)物病毒直穿細(xì)胞膜；細(xì)胞內(nèi)吞：累積在細(xì)胞質(zhì)的小泡內(nèi)→釋放；膜融合：包膜和細(xì)胞膜融合。3.植物病毒：傷口或口器侵入。第22頁/共43頁（三）生物合成

1.特點(diǎn)：時(shí)序性。

早期轉(zhuǎn)錄→→次早期轉(zhuǎn)錄→→晚期基因表達(dá)。以E.coli的T偶數(shù)雙鏈?zhǔn)删w為例。第23頁/共43頁早期mRNA早期蛋白(次早期RNA聚合酶)次早期mRNA次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶等)晚期mRNA晚期蛋白(衣殼蛋白、裝配酶等)核酸(DNA)復(fù)制宿主細(xì)胞RNA聚合酶dsDNA次早期DNA晚期基因第24頁/共43頁2.核酸復(fù)制（1）基本規(guī)律雙鏈為半保留，單鏈先合成互補(bǔ)鏈，再復(fù)制。（2）病毒DNA或RNA的復(fù)制雙鏈DNA和雙鏈RNA復(fù)制（半保留復(fù)制）單鏈+DNA和+RNA復(fù)制先合成負(fù)鏈，再合成正鏈。單鏈-RNA復(fù)制

-RNA→+RNA(即mRNA)

→

-RNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒單鏈RNA復(fù)制RNA→DNA→

雙鏈DNA→單鏈RNA。第25頁/共43頁（四）、裝配（五）、釋放裂解和出芽。第26頁/共43頁二、一步生長曲線（描述烈性噬菌體的復(fù)制）1.具體操作敏感菌+噬菌體（10/1)。噬菌體抗血清→去除游離噬菌體。將培養(yǎng)液高倍稀釋→終止抗血清作用。定時(shí)取樣0.5mL+0.5mL敏感菌懸液+5mL半固體培養(yǎng)基混勻→37℃培養(yǎng)，12h→觀察測定噬菌斑數(shù)。繪制一次生長曲線（以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌斑數(shù)為縱坐標(biāo)）。第27頁/共43頁時(shí)間噬菌斑數(shù)潛伏期裂解期平穩(wěn)期一步生長曲線2.三個(gè)特征數(shù)據(jù)：潛伏期，裂解期和裂解量。裂解量=穩(wěn)定期病毒效價(jià)/潛伏期病毒效價(jià)第28頁/共43頁第四節(jié)非增殖性感染與缺損病毒侵染后，不產(chǎn)生有感染性子代病毒粒子。一、非增殖性感染的類型1.流產(chǎn)感染(abortiveinfection)2.限制性感染(restrictiveinfection)3.潛伏感染(latentinfection)第29頁/共43頁1.流產(chǎn)感染（1）依賴于細(xì)胞非允許細(xì)胞不能復(fù)制(缺乏復(fù)制酶、tRNA或細(xì)胞因子)如：人腎細(xì)胞允許→人腺病毒；猴腎細(xì)胞非允許。（2）依賴于病毒病毒基因組不完整（缺損病毒）。病毒第30頁/共43頁2.限制性感染

細(xì)胞瞬時(shí)允許，病毒不能復(fù)制或僅有少數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生病毒。如：人乳頭瘤病毒，感染各分化期的上皮細(xì)胞，不能晚期轉(zhuǎn)錄。感染分化成熟的鱗狀上皮細(xì)胞→晚期轉(zhuǎn)錄。3.潛伏感染在細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)病毒，不破壞細(xì)胞?？捎刹《净虮磉_(dá)，改變宿主→惡性細(xì)胞。第31頁/共43頁二、缺損病毒主要為基因組有缺陷，須依賴其他病毒才能復(fù)制。1.干擾缺損病毒(干擾缺損顆粒)

(defectiveinterferingparticles)——DI顆粒2.衛(wèi)星病毒3.條件缺損病毒4.整合的病毒基因組第32頁/共43頁1.DI顆粒復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的基因缺失突變體。各病毒均可產(chǎn)生，在高感染復(fù)數(shù)(m.o.i)時(shí)產(chǎn)生頻率最高。

m.o.i：每一敏感細(xì)胞表面吸附病毒的數(shù)量。

m.o.i=1-300須依賴于同源完全病毒才能復(fù)制，但基因組小，干擾完全病毒復(fù)制。第33頁/共43頁2.衛(wèi)星病毒絕對(duì)缺損，形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原性與輔助病毒不同，少有同源性。衛(wèi)星病毒：E.coliP4噬菌體(缺殼體蛋白編碼基因)輔助病毒：E.coliP2噬菌體殼體蛋白（合成P4噬菌體外殼）第34頁/共43頁3.條件缺損病毒

條件致死突變體，在允許條件→正常增殖；非允許條件→流產(chǎn)感染或死亡。4.整合的病毒基因組溫和噬菌體和腫瘤病毒。（1）溫和噬菌體（核酸都是dsDNA

）有游離噬菌體（游離態(tài)）、原噬菌體（整合態(tài)或質(zhì)粒形式）和營養(yǎng)噬菌體（營養(yǎng)態(tài)）三種存在形式。第35頁/共43頁（2）溶源菌①特征溶源性可遺傳可（自發(fā)或誘發(fā)）裂解有免疫性復(fù)愈：輻射或氮芥處理，有些菌體會(huì)失去原噬菌體。溶源轉(zhuǎn)變：除免疫性以外獲得新性狀。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)第36頁/共43頁②檢出方法紫外線照射；將少量溶源菌和大量敏感菌混合，倒平板培養(yǎng)，觀察。出現(xiàn)獨(dú)特噬菌斑→溶源菌。敏感菌菌苔溶源菌菌落透明裂解斑第37頁/共43頁（3）腫瘤病毒的整合感染腫瘤病毒（如乙肝病毒）或RNA病毒，一定條件下可轉(zhuǎn)入復(fù)制循環(huán)，產(chǎn)生子代病毒。DNA病毒：直接整合。RNA病毒：如逆轉(zhuǎn)錄病毒。第38頁/共43頁第五節(jié)亞病毒一、衛(wèi)星RNA（擬病毒）單鏈RNA片段，在輔助病毒衣殼內(nèi)，無單獨(dú)侵染性。與輔助病毒無明顯同源性。二、類病毒

有單獨(dú)侵染性，單鏈環(huán)狀RNA。（其RNA無mRNA活性）第39頁/共43頁三、朊病毒：獨(dú)立復(fù)制、無免疫性的疏水性角蛋白。1982年，美，prusiner發(fā)現(xiàn)→1996年諾貝爾獎(jiǎng)。引起的疾?。函偱２。ㄅ：＞d狀腦?。?；羊癢疫（羊搔癢癥）；人的克-雅氏癥（老年癡呆癥）等。第40頁/共43頁第六節(jié)病毒的可利用價(jià)值1.疾病防治防治痢疾桿菌、耐藥性的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌。2.清除藻類污染3.防治害蟲和植物病害：多角體、真菌病毒，衛(wèi)星RNA等。4.基因工程工具酶：聚合酶、連接