實驗六細胞核的分離與核酸的鑒定

實驗六細胞核的分離與核酸的鑒定第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

1.掌握離心技術的原理及離心機的使用；2.熟悉提取分離細胞核、細胞質的方法；3.熟悉鑒定核酸的方法；

第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

一、分離細胞質與細胞核

１.破碎細胞細胞破碎的方法機械法高速組織搗碎機玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學法自溶法酶處理表面活性劑處理法第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六利用各細胞器在一定介質中的沉降速度的差異，可采取離心的方法，將細胞器分離出來。２.離心技術細胞器沉降先后順序先后是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六離心方法差速沉降離心法

速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法

√√第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六差速沉降離心法(differentialcentrifugation)采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。

加速低速高速第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。

缺點：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應嚴重，特別是當顆粒很大或濃度很高 時，在離心管一側會出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆 粒變形、聚集而失活。

第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六每種純樣品成份在介質溶液中的沉降速度可以表為：

V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）；d：樣品顆粒的直徑（厘米）；σ：樣品顆粒的密度（克/厘米3）；s：介質溶液的密度（克/厘米3）；η：介質溶液的粘性系數(shù)（克/厘米·秒）；ω：離心機重軸的旋轉角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：轉/分；

r：顆粒所在位置與旋轉軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；密度梯度離心法的理論依據(jù)第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六待分樣品的沉浮行為如何確定？當σ>S時V>0即樣品順離心力方向沉降

σ<S時V<0即樣品逆離心力方向上浮

σ=S時V=0即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定”在這一位置

用這個公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或等密度區(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨?。第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六速率區(qū)帶離心法人為地加入不同密度的活性物質，形成一個較為平緩的介質梯度，將樣品加在介質中進行離心，在一定的離心力下根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

此法用于分離具有一定沉降速度差的顆粒（沉降速度差為20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白質。適用于分離密度相似而大小有別的樣品。第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質溶液中進行離心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度區(qū)帶離心法。

等密度區(qū)帶離心法此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點：a.分離效果好，可一次獲得較純顆粒。

b.適應范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降 系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒。

c.顆粒不會擠壓變形。缺點：a.離心時間較長；

b.需要制備梯度；操作嚴格，不易掌握。密度梯度區(qū)帶離心法(densitygradientcentrifugation)第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

1、核酸的種類及其分布請思考？

DNA、RNA在細胞中的分布：DNA胞核內(98%)胞質內(2%)RNA胞核內(10%)胞質內(90%)

核酸的種類：DNA、RNA結論：DNA主要存在于細胞核，RNA主要存在于細胞質。二、核酸的鑒定第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

2、核酸的水解核酸

核苷酸

磷酸

堿基

戊糖

定糖法（戊糖的差異）第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（1）核糖核酸的鑒定濃HCl＋3H2O+

β－

D－核糖

糠醛

糠醛

3，5－二羥基甲苯

綠色化合物

RNA

ＯＨˉ

水解

β－

D－核糖

第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（2）脫氧核糖核酸的鑒定

DNAＨ＋

水解

β－D－２－脫氧核糖-H2O硫酸脫氧核糖

ω－羥基－γ－酮基戊醛藍色化合物第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（1）分離細胞質與細胞核（1）分離細胞質與細胞核（2）核酸的鑒定第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六0.5g肝組織＋少許石英砂研磨加5ml的1.5%檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾

肝勻漿，傾入離心管離心：3000r/min；10′上層液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖檸檬酸溶液

核懸液沿壁緩鋪于8ml

0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；5′上層液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀，離心：2000r/min，5′上層液（棄去）沉淀初步純化的細胞核

5ml0.02mol/LNaOH溶解細胞核待測樣品鑒定實驗流程圖第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

編號12細胞質（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:編號123細胞質水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羥基甲苯液（滴）3030301.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：（2）核糖核酸的鑒定混合各管沸水浴(10′)冷卻加入5%三氯醋酸(8ml)攪勻后離心

2000r/min；5′上清液

立即混合各管沸水浴(10′)冷卻比較各管顏色

第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

2．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:1.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：編號12細胞質（滴）20-核液（滴）-201mol/L過氯酸(滴）2020編號123細胞質水解液（滴）20--核水解液（滴）-20-1mol/L過氯酸（滴）20二苯胺試劑（滴）202020（3）脫氧核糖核酸的鑒定混合各管冷卻離心

上清液

立即混合各管冷卻比較各管顏色

2000r/min;5′第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六表1.核糖核酸的鑒定試管編號123現(xiàn)象試管編號123現(xiàn)象表2.脫氧核糖核酸的鑒定第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六1．規(guī)范操作，防止滴管、試劑的污染。細核懸液的平鋪要輕柔；濃酸的取用要小心；使用離心機注意平衡，轉速從低到高；第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六思考1.本實驗結束后若想繼續(xù)測定肝臟中DNA、RNA的含量，可用什么方法？

2.我們已經(jīng)學習了電泳法和層析法來分離蛋白質，請問我們是否可以用這兩種方法分離DNA、RNA？若能，請簡單敘述其原理。第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六實驗七血糖測定（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶 法）及腎上腺素對血糖濃度的影響1.血糖的來源與去路？2.激素對血糖的調節(jié)？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.實驗原理及操作步驟。下次實驗預習內容第25頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六生物化學設計性實驗安排經(jīng)討論決定，本學期第八次實驗是設計性實驗，也作為實驗考核內容，占實驗總成績的30%（共9分）。一.內容：牛血清白蛋白的提取與鑒定二.設計方案的要求和時間：要求每大組1份，寫明實驗目的、實驗原理、操作步驟或流程、儀器和試劑、預測結果、參考文獻或資料等項目。于第七次試驗前完成，第七次實驗時交給相應實驗室的實驗教師。實驗設計成績4分（科學合理3分、可操作性1分）三.實驗實施的時間和要求：按最后一次實驗的時間安排，分班按課程表進行實驗，要求每人獨立完成實驗操作并當堂完成實驗報告。實驗操作成績3分（基本操作1分、試劑盤整理有序1分、實驗環(huán)境衛(wèi)生1分）實驗報告成績2分（目的原理0.5分、操