實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定

實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

1.掌握離心技術(shù)的原理及離心機(jī)的使用；2.熟悉提取分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的方法；3.熟悉鑒定核酸的方法；

第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

一、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核

１.破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學(xué)法自溶法酶處理表面活性劑處理法第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六利用各細(xì)胞器在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取離心的方法，將細(xì)胞器分離出來。２.離心技術(shù)細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六離心方法差速沉降離心法

速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法

√√第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六差速沉降離心法(differentialcentrifugation)采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。

加速低速高速第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。

缺點(diǎn)：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高 時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆 粒變形、聚集而失活。

第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六每種純樣品成份在介質(zhì)溶液中的沉降速度可以表為：

V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）；d：樣品顆粒的直徑（厘米）；σ：樣品顆粒的密度（克/厘米3）；s：介質(zhì)溶液的密度（克/厘米3）；η：介質(zhì)溶液的粘性系數(shù)（克/厘米·秒）；ω：離心機(jī)重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：轉(zhuǎn)/分；

r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；密度梯度離心法的理論依據(jù)第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六待分樣品的沉浮行為如何確定？當(dāng)σ>S時V>0即樣品順離心力方向沉降

σ<S時V<0即樣品逆離心力方向上浮

σ=S時V=0即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定”在這一位置

用這個公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或等密度區(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨椤５?0頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六速率區(qū)帶離心法人為地加入不同密度的活性物質(zhì)，形成一個較為平緩的介質(zhì)梯度，將樣品加在介質(zhì)中進(jìn)行離心，在一定的離心力下根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

此法用于分離具有一定沉降速度差的顆粒（沉降速度差為20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)。適用于分離密度相似而大小有別的樣品。第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質(zhì)溶液中進(jìn)行離心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度區(qū)帶離心法。

等密度區(qū)帶離心法此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點(diǎn)：a.分離效果好，可一次獲得較純顆粒。

b.適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降 系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒。

c.顆粒不會擠壓變形。缺點(diǎn)：a.離心時間較長；

b.需要制備梯度；操作嚴(yán)格，不易掌握。密度梯度區(qū)帶離心法(densitygradientcentrifugation)第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

1、核酸的種類及其分布請思考？

DNA、RNA在細(xì)胞中的分布：DNA胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)(2%)RNA胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)(90%)

核酸的種類：DNA、RNA結(jié)論：DNA主要存在于細(xì)胞核，RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)。二、核酸的鑒定第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

2、核酸的水解核酸

核苷酸

磷酸

堿基

戊糖

定糖法（戊糖的差異）第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（1）核糖核酸的鑒定濃HCl＋3H2O+

β－

D－核糖

糠醛

糠醛

3，5－二羥基甲苯

綠色化合物

RNA

ＯＨˉ

水解

β－

D－核糖

第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（2）脫氧核糖核酸的鑒定

DNAＨ＋

水解

β－D－２－脫氧核糖-H2O硫酸脫氧核糖

ω－羥基－γ－酮基戊醛藍(lán)色化合物第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（2）核酸的鑒定第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六0.5g肝組織＋少許石英砂研磨加5ml的1.5%檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾

肝勻漿，傾入離心管離心：3000r/min；10′上層液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖檸檬酸溶液

核懸液沿壁緩鋪于8ml

0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；5′上層液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀，離心：2000r/min，5′上層液（棄去）沉淀初步純化的細(xì)胞核

5ml0.02mol/LNaOH溶解細(xì)胞核待測樣品鑒定實(shí)驗(yàn)流程圖第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

編號12細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羥基甲苯液（滴）3030301.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：（2）核糖核酸的鑒定混合各管沸水浴(10′)冷卻加入5%三氯醋酸(8ml)攪勻后離心

2000r/min；5′上清液

立即混合各管沸水浴(10′)冷卻比較各管顏色

第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六

2．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:1.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：編號12細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核液（滴）-201mol/L過氯酸(滴）2020編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20--核水解液（滴）-20-1mol/L過氯酸（滴）20二苯胺試劑（滴）202020（3）脫氧核糖核酸的鑒定混合各管冷卻離心

上清液

立即混合各管冷卻比較各管顏色

2000r/min;5′第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六表1.核糖核酸的鑒定試管編號123現(xiàn)象試管編號123現(xiàn)象表2.脫氧核糖核酸的鑒定第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六1．規(guī)范操作，防止滴管、試劑的污染。細(xì)核懸液的平鋪要輕柔；濃酸的取用要小心；使用離心機(jī)注意平衡，轉(zhuǎn)速從低到高；第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六思考1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后若想繼續(xù)測定肝臟中DNA、RNA的含量，可用什么方法？

2.我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了電泳法和層析法來分離蛋白質(zhì)，請問我們是否可以用這兩種方法分離DNA、RNA？若能，請簡單敘述其原理。第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)七血糖測定（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶 法）及腎上腺素對血糖濃度的影響1.血糖的來源與去路？2.激素對血糖的調(diào)節(jié)？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟。下次實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)內(nèi)容第25頁，共26頁，2023年，2月20日，星期六生物化學(xué)設(shè)計性實(shí)驗(yàn)安排經(jīng)討論決定，本學(xué)期第八次實(shí)驗(yàn)是設(shè)計性實(shí)驗(yàn)，也作為實(shí)驗(yàn)考核內(nèi)容，占實(shí)驗(yàn)總成績的30%（共9分）。一.內(nèi)容：牛血清白蛋白的提取與鑒定二.設(shè)計方案的要求和時間：要求每大組1份，寫明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟或流程、儀器和試劑、預(yù)測結(jié)果、參考文獻(xiàn)或資料等項(xiàng)目。于第七次試驗(yàn)前完成，第七次實(shí)驗(yàn)時交給相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)教師。實(shí)驗(yàn)設(shè)計成績4分（科學(xué)合理3分、可操作性1分）三.實(shí)驗(yàn)實(shí)施的時間和要求：按最后一次實(shí)驗(yàn)的時間安排，分班按課程表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，要求每人獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)操作并當(dāng)堂完成實(shí)驗(yàn)報告。實(shí)驗(yàn)操作成績3分（基本操作1分、試劑盤整理有序1分、實(shí)驗(yàn)環(huán)境衛(wèi)生1分）實(shí)驗(yàn)報告成績2分（目的原理0.5分、操