實(shí)驗(yàn)二-萌發(fā)麥苗淀粉酶活性測(cè)定

#/6實(shí)驗(yàn)二萌發(fā)麥苗淀粉酶活性的測(cè)定生物周泓兆一、研究背景及目的酶作為生物體內(nèi)最重要的催化劑，其活性尤其受到關(guān)注。在這次實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)一些經(jīng)典經(jīng)典酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，對(duì)比其思路與設(shè)計(jì)差異，了解測(cè)定酶活力的基本方向和實(shí)驗(yàn)技巧。完成小麥萌發(fā)過程中淀粉酶活力的測(cè)定并分析測(cè)定結(jié)果是否合理。二、原理淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麥芽糖。本實(shí)驗(yàn)便是通過測(cè)定淀粉酶在一定時(shí)間內(nèi)分解淀粉所產(chǎn)生的麥芽糖總量來測(cè)定酶的活性。根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點(diǎn)和現(xiàn)有測(cè)定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)（毫克麥芽糖克鮮重分1。本實(shí)驗(yàn)涉及a-淀粉酶與B-淀粉酶，我們可通過鈍化B-淀粉酶的方法單獨(dú)測(cè)定a-淀粉酶的活性。本實(shí)驗(yàn)所使用的一二硝基水楊酸法是一種對(duì)還原糖定量測(cè)定的方法。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測(cè)定樣品中還原糖以及總糖的量。麥芽糖是還原性糖，可用該方法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。三、儀器與試劑儀器： 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）， 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）， 架盤藥物天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）， 架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）TOC\o"1-5"\h\z試劑：麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液， 的檸檬酸緩沖液， 二硝基水楊酸溶液， ，酚試劑甲， 酚試劑乙，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（ ）材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)約 ）四、實(shí)驗(yàn)方法/操作步驟、酶液的制備：稱取兩克萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到容量瓶中至左右，室溫浸提 分鐘，浸提充分后定容至刻度，混勻后 離心，取上清液備用（初始酶液）。2取支試管，分別編號(hào)a測(cè)定管、a測(cè)定管、a對(duì)照管、a對(duì)照管、ap測(cè)定管、ap測(cè)定管、ap對(duì)照管、ap對(duì)照管與 3在a測(cè)定管、a測(cè)定管、a對(duì)照管、a對(duì)照管中各加入酶液在℃恒溫水浴中準(zhǔn)確加熱 ，取出后立即在冰浴中冷卻至室溫或更低。取出后分別在四支試管中各加入 檸檬酸緩沖液，置于℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫。之后向兩支對(duì)照管中各加入 ，再向各管分別加入℃下預(yù)熱的淀粉溶液，搖勻，立即于0水浴中準(zhǔn)確保溫,然后向兩支測(cè)定管分別迅速加入 ，搖勻備用。、取制備的酶液，放入 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻后，在ap測(cè)定管、ap測(cè)定管、ap對(duì)照管、ap對(duì)照管中各加入稀釋后的酶液與 檸檬酸緩沖液置于℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫 。之后向兩支對(duì)照管中各加入 ，再向各管分別加入0下預(yù)熱的淀粉溶液，搖勻，立即于℃水浴中準(zhǔn)確保溫 ，然后向兩支測(cè)定管分別迅速加入 4搖勻備用。TOC\o"1-5"\h\z5取編號(hào) 的七支試管，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液I）、 .. . . . 0然后將各管用蒸餾水準(zhǔn)確補(bǔ)充至 ，搖勻。6在a測(cè)定管、a測(cè)定管、a對(duì)照管、a對(duì)照管、ap測(cè)定管、aB測(cè)定管、ap對(duì)照管、ap對(duì)照管與、、、、、、管內(nèi)各加入 二硝基水楊酸試劑混勻，同時(shí)在沸水浴中準(zhǔn)確保溫 ，取出冷卻，用蒸餾水稀釋到 ，混勻。7依次取各試管溶液在 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄消光值。以 管消光值作為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。8 酚測(cè)萌發(fā)麥苗水溶性蛋白含量：稱取 萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到 容量瓶中至左右，室溫浸提 分鐘，浸提充分后定容至刻度，混勻后 離心、取上清液備用。9、取9支具塞試管，分別標(biāo)上待測(cè)液1、待測(cè)液2、待測(cè)液3與F1-F6。分別在F1-F6中加入標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,然后將各管用蒸餾水補(bǔ)充到1.0ml。再各取1ml上清液（步驟）于標(biāo)有待測(cè)液1、待測(cè)液2、待測(cè)液3的試管中。在這九支試管中各加試劑甲5ml,混勻后室溫下放置10min,再加試劑乙0.5ml,立即混勻，30min后測(cè)定各管的OD650。五、數(shù)據(jù)整理樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)均值管號(hào)a測(cè)定管a測(cè)定管a對(duì)照管a對(duì)照管ap測(cè)定管ap測(cè)定管ap對(duì)照管ap對(duì)照管均值樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)液管號(hào)待測(cè)液待測(cè)液待測(cè)液均值六、結(jié)果計(jì)算與討論分析根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:

標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得:管號(hào)a測(cè)定管a測(cè)定管a對(duì)照管a對(duì)照管aB測(cè)定管aB測(cè)定管aB對(duì)照管aB對(duì)照管麥芽糖濃度（ ）結(jié)果計(jì)算：a淀粉酶活性（毫克麥芽糖克鮮重分） 樣品稀釋總體積樣品重（）（毫克麥芽糖克鮮重分）（a+）淀粉酶總活性（毫克麥芽糖克鮮重分） 樣品稀釋總體積樣品重（） （毫克麥芽糖克鮮重分）A—a-淀粉酶測(cè)定管中的麥芽糖中的濃度A'—a-淀粉酶對(duì)照管中的麥芽糖濃度B—a及B淀粉酶總活性測(cè)定管中的麥芽糖濃度B′—a-及B-淀粉酶總活性對(duì)照管中的麥芽糖濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得：稀釋后溶液的蛋白質(zhì)濃度⑺g/ml）=240.9^g/ml結(jié)果計(jì)算：稀釋倍數(shù)為 .可得酶液的蛋白質(zhì)濃度⑺ ） 00 =（aB）淀粉酶總比活（aB）淀粉酶總活性（毫克麥芽糖克鮮重分）酶液的蛋白質(zhì)濃度（0 ）酶液總體積（） （毫克麥芽糖克鮮重分）M我們可以看出平行數(shù)據(jù)之間的誤差在允許的范圍之內(nèi)說明3,5二硝基水楊酸法測(cè)定生成麥芽糖的濃度是可行的。而a淀粉酶活性與（a+）淀粉酶總活性差距極大很可能是因?yàn)槊傅膮f(xié)助作用，或是一部分有協(xié)助分解淀粉作用的酶在℃時(shí)與B淀粉酶一同失活。七、結(jié)論與展望通過以上的實(shí)驗(yàn)方法，我們對(duì)淀粉酶的活性進(jìn)行了測(cè)定。并且我們發(fā)現(xiàn)a+）淀粉酶總活性遠(yuǎn)高于a淀粉酶活性，小麥淀粉酶的總比活為 .八、思考題及質(zhì)疑.完成這次小小的蛋白含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)從設(shè)計(jì)到實(shí)施完成的自我經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。答：這次蛋白實(shí)驗(yàn)的主要難點(diǎn)在于蛋白溶液的稀釋倍數(shù)。在設(shè)計(jì)時(shí)我考慮使用濃度梯度的方法來使得稀釋后酶液濃度落在工作曲線內(nèi)，其實(shí)實(shí)際操作時(shí)通過不斷稀釋即可。而且設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)我強(qiáng)調(diào)“可溶性蛋白”，于是考慮了溶解度的問題，并且設(shè)計(jì)了 的離心過程，后來發(fā)現(xiàn)這樣使得蛋白含量與酶活性之間喪失了可比性（因?yàn)殡x心程度不同了）。因此我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)是：聯(lián)系本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，盡可能減少變量的數(shù)目2從酶活測(cè)定的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶活測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)是否合理？為什么？答：根據(jù)我們組和其它小組的經(jīng)驗(yàn)，本次a淀粉酶活性測(cè)定結(jié)果均靠近甚至稍微超過工作曲線，因此我們覺得應(yīng)當(dāng)再稀釋一倍后進(jìn)行測(cè)定。3眾多測(cè)定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均是采取鈍化B淀粉酶的活力而測(cè)a淀粉酶和測(cè)總酶活力的策略，為何不采取鈍化a淀粉酶活力去測(cè)B淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說明什麼？答：鈍化B淀粉酶可以采取高溫的方法，而鈍化a淀粉酶則需要采用酸性環(huán)境。若在實(shí)驗(yàn)中采取鈍化a淀粉酶的方式，則在將調(diào)回的的過程中a淀粉酶會(huì)有很大一部分復(fù)性。而高溫處理后立即冰浴，則可以大大減少B淀粉酶的復(fù)性。其次，在實(shí)驗(yàn)中，酶對(duì)更加敏感，若酸過量則會(huì)導(dǎo)致B淀粉酶也被鈍化，相對(duì)而言，溫度更加易于控制。這種設(shè)計(jì)思路說明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要考慮其在操作時(shí)的合理性，使實(shí)驗(yàn)操作盡可能簡(jiǎn)便。4a淀粉酶活性測(cè)定時(shí)℃水浴為何要嚴(yán)格保溫分鐘？保溫后為什么要立即于冰浴中驟冷？而經(jīng)如此處理，為什么在隨后的0溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證B淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。答，保溫時(shí)間過短B淀粉酶失活不完全，時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致a淀粉酶也有一部分被鈍化，所以要嚴(yán)格保溫分鐘。立即于冰浴中驟冷是為了減小B淀粉酶在降溫過程中的復(fù)性。經(jīng)過巨大的溫度變化，不耐高溫的B淀粉酶會(huì)徹底失活，所以在隨后的0溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證B淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。5酶的最適反應(yīng)溫度（一般都是生理溫度）和最適保存溫度（一般C以下）為什么不一樣？而這兩個(gè)狀態(tài)都是需要維護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)。答：最適反應(yīng)溫度時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)最適合誘導(dǎo)底物與之結(jié)合形成酶底物復(fù)合物，因此體現(xiàn)出酶的活性最強(qiáng)。而在最適保存溫度時(shí)，酶的穩(wěn)定性最好，催化能力很低，從而很好地保存Y酶的活性。為什么3二硝基水楊酸與還原糖的反應(yīng)要先沸水浴然后再稀釋測(cè)定？答：原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。因此在沸水浴時(shí)，溶液濃度越大反應(yīng)越完全。而在比色法測(cè)定時(shí)，濃度過大無法測(cè)定，因此需要稀釋以后進(jìn)行測(cè)定，使數(shù)據(jù)盡可能符合朗伯-比爾定律。在設(shè)計(jì)酶活測(cè)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)，要求酶促反應(yīng)初速度對(duì)底物濃度的小量變化不敏感，具體要求為：在底物濃度有 的變化幅度范圍內(nèi)，而所測(cè)初速度的變化幅度小于。則應(yīng)該大于多少才能保證這一點(diǎn)？（設(shè)定為米氏酶）答：根據(jù)米氏方程： ，根據(jù)題意： W' ，則WW 計(jì)算可得： > 。轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)的作用及生理意義？細(xì)胞內(nèi)有眾多的轉(zhuǎn)氨酶，但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（）的活力，而極少測(cè)定其它轉(zhuǎn)氨酶活力，你推測(cè)可能的原因會(huì)是什么？為什么？答：轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)催化酮酸與氨基酸或氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，可以生成非必須氨基酸或產(chǎn)生酮酸分解產(chǎn)能或作為糖和脂肪酸的原料。轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中作用巨大，其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（）最為重要。前者是催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，后者是催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，其反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸和草酰乙酸都是代謝的重要中間產(chǎn)物，而且和的活性在人體轉(zhuǎn)氨酶中是最高的，所以但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（）的活力。9轉(zhuǎn)氨酶催化的是雙底物可逆反應(yīng)，根據(jù)酶活力測(cè)定的總體思路，要保證測(cè)定反應(yīng)的初速度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)所提供的資料，你認(rèn)為是否保證了這一點(diǎn)？是如何保證的？答：保證了這一點(diǎn)。通過加入過量的底物促進(jìn)了正反應(yīng)進(jìn)行，而且適當(dāng)增長(zhǎng)了反應(yīng)時(shí)間，使正反應(yīng)反應(yīng)充分。、指導(dǎo)所提供的兩個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)的酶促反應(yīng)時(shí)間是多少？終止酶促反應(yīng)用的什么試劑？與淀粉酶活力測(cè)定規(guī)定的酶促反應(yīng)時(shí)間相比是否有差異？差異可能的原因你分析認(rèn)為會(huì)是因?yàn)槭裁?？答：酶促反?yīng)的時(shí)間是 ，用 終止酶促反應(yīng)，時(shí)間較淀粉酶活力測(cè)定規(guī)定的酶促反應(yīng)的時(shí)間 要多，我認(rèn)為差異的原因?yàn)榉勖复?/p>