光合細(xì)菌培養(yǎng)

光合細(xì)菌簡稱PSB,是一群能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用有機(jī)物作物供氧體兼碳源，進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌，廣泛公布于水田、湖泊、沼澤、江河，海洋、活性污泥和土壤中。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的光合細(xì)菌主要有紅假單胞菌(Rhodopseudomas)、紅螺菌(Rhodospirillum^紅硫細(xì)菌(又稱著色菌，Chromatium)、綠硫細(xì)菌(Chlorobium)4個(gè)屬種。光合細(xì)菌菌體含蛋白質(zhì)60%以上，含有動(dòng)物和植物所需全部氨基酸和豐富的維生素，特別是B族維生素幾乎都有，還具有較高含量的生理活性物質(zhì)輔酶Q等，是一種高營養(yǎng)型微生物的屬種。紅硫細(xì)菌和綠硫細(xì)菌主要以硫化氧、硫代硫酸鹽等作為供氧體及電子受體，且是專性厭氧細(xì)菌，用于池塘和水田后可增強(qiáng)對(duì)土層中硫化物的降解，細(xì)螺菌能利用有機(jī)物進(jìn)行光能異養(yǎng)，無論在光照有氧或黑暗無氧的環(huán)境條件下都利用有機(jī)物，把高分子的碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生單糖、低脂肪酸、氨基酸等低分子物質(zhì)。紅假單胞菌細(xì)胞壁中所含的多糖類為廣譜的非特異性免疫激活劑，起到防抗病害的作用。光合細(xì)菌菌種可從采集的淡、咸水池塘中重復(fù)富集、分離、純化獲得。如用保存下來的菌種，在培養(yǎng)前必須復(fù)壯，才能有效地進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，復(fù)合型菌株可以利用多種碳源，更容易培養(yǎng)。1.1復(fù)合型光合細(xì)菌的菌種分離與生產(chǎn)性擴(kuò)繁培養(yǎng)1.1.1光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)與分離純化條件無菌室、超凈臺(tái)、平皿、密封玻璃試管、接種針、玻璃棒、固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、高壓鍋、加熱器、生化培養(yǎng)箱等。無菌室內(nèi)操作步驟：1、將適量瓊脂固體培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌20min后，倒入若十個(gè)平皿冷卻至45C以下，制成固體培養(yǎng)基待用。2、取光合細(xì)菌菌液，分別用蒸餾水以10萬倍、50萬倍、100萬倍、500萬倍、5000萬倍、10000萬倍稀釋。3、分別從每個(gè)稀釋倍液中取lml的樣本各10個(gè)，均勻涂布于貼好相應(yīng)標(biāo)簽的平皿內(nèi)固體瓊脂培養(yǎng)基平面上。4、將平皿放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h-50h如菌落末成長，再繼續(xù)培養(yǎng)，直到有明顯的菌落長成為止。5、光合細(xì)菌各屬種的菌落顏色、形成各不相同，根據(jù)光合細(xì)菌菌落特征，找出光合細(xì)菌菌落，并計(jì)數(shù)。取同稀釋倍液10個(gè)樣本菌落的平均數(shù)，乘以它的稀釋倍數(shù)，即為每毫升的活菌數(shù)注意菌落的雜菌和光合細(xì)菌交錯(cuò)在一起，或兩個(gè)以上光合細(xì)菌菌落合在一起的，分辯計(jì)數(shù)。6、用接種針將光合細(xì)菌菌落挑出，用適量蒸餾水稀釋后，再涂布于固體培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，待光合細(xì)菌在培養(yǎng)基上再次長成菌落后，在超凈臺(tái)內(nèi)用接種針挑出，接入有經(jīng)高壓滅菌過的液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，進(jìn)行密封厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)好的光合細(xì)菌就是純菌種。1.1.1培養(yǎng)基酵母粉3g、蛋自陳3g、MgS04.7H2O、CaCl20.3g、蒸餾水1000ml、pH6.8-7.0。如制固體培養(yǎng)基再加20%瓊脂。光合細(xì)菌培養(yǎng)基2:溶液1:CaCl275mg、CH3COONal.6g、煙酸40mg、NaCll.5g、生物素40mg、酵母膏2g、硫胺素40mg、MgCl2200mg、EDTA-Fe溶液5ml、微量元素溶液lml、蒸餾水800ml溶液11:KH2P04600mg、K2HP04.3H201.18g.蒸餾水200ml將溶液1、溶液11分別于12l°C高壓滅菌15min,冷卻后將溶液1、溶液11混勻。微量元素溶液制備，EDTA-Na2g、HB0100mg、ZnCl100mg、NaM0.2HO、2b33?2?204220mg、CaCl2l0mg、FeSO42.0g、COC1.6H2O100mg、MnC12-4H2O100mg、NiCl2.6H2020mg、Na2SeO31mg蒸餾水1000ml。EDTA-Fe溶液制備：EDTA-N^20.0g、FeSO4.7H2020.0g蒸餾水l000mlEDTA-Fe溶液制備需要通氣過夜，維生素物質(zhì)要過濾除菌后按量加入到培養(yǎng)基中。如制固體培養(yǎng)基再加20%瓊指NH4Cll.0g、NaHC031.0g、CH3COONa3.0g、KH2P040.3g>MgS04.7H200.1g、酵母膏0.5g、蛋白陳0.5g、微量元素溶液（同上血1）dOW。如制固體培養(yǎng)基再加20%瓊脂。1.1.3培養(yǎng)條件pH值:光合細(xì)菌生長的酸堿度范圍為微酸性到中性，pH在6.5-7.8，在培養(yǎng)過程中，需要定時(shí)測定培養(yǎng)液的pH值變化。光照:室內(nèi)用25-60W白熾燈作光源，注意培養(yǎng)物不能離燈炮太近，光照強(qiáng)度一般為1000-200Lux。溫度:光合細(xì)菌適溫為10-35°C，最適25-28°C。光合細(xì)菌可耐較高溫度，在40-42C時(shí)仍能生長正常。1.1.4光合細(xì)菌生長性三級(jí)培養(yǎng)法一級(jí)培養(yǎng)，采用試管或小型鹽水瓶，其生長培養(yǎng)需先經(jīng)121C高壓滅菌20min，然在無菌條件下，按規(guī)程進(jìn)行接種，接種量10%?20%，接種后于適宜溫度與光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。二級(jí)培養(yǎng)，采用5000?20000ml玻璃瓶，擴(kuò)繁培養(yǎng)基需煮沸消毒，待冷卻到25C左右接種，接種量10%?20%。三級(jí)培養(yǎng):采用25kg?5Okg塑料桶或玻璃鋼桶，培養(yǎng)液用次氯酸鈉消毒12h-24h,再用硫代硫酸鈉還原后接種培養(yǎng)。接種量20%-30%,第一次培養(yǎng)需要5d以上，菌種適應(yīng)當(dāng)?shù)厮醇碍h(huán)境后，一般只需要2d即可長成深紅色合格成品。培養(yǎng)成熟的標(biāo)準(zhǔn)，以培養(yǎng)液長成深紅色為準(zhǔn)，一般成品的光合細(xì)菌落數(shù)可達(dá)到30億-100億/毫升以上。1.1.5光合細(xì)菌微生物菌制產(chǎn)品的保存光合細(xì)菌菌液成品應(yīng)放在低溫環(huán)境下，5°C以上最好，夏季應(yīng)在涼爽的地萬，并要保持一定的光照度，每天不低于2h,以滿足光合細(xì)菌生長慣性（這是因?yàn)楣夂霞?xì)菌在剛剛結(jié)束培養(yǎng)時(shí)，正處于生長旺盛期，形成了很強(qiáng)的慣性生長，如果此時(shí)突然沒有了光照或光照很弱，經(jīng)5d-10d后會(huì)出現(xiàn)光合作用失衡而導(dǎo)致大量死亡，使菌液發(fā)黑，并有惡臭，剛開