DNA測序技術(shù)的發(fā)展

（優(yōu)選）DNA測序技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)在是1頁\一共有44頁\編輯于星期日一、DNA序列測定的意義二、測序技術(shù)的建立三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測序技術(shù)的展望五、DNA測序技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)在是2頁\一共有44頁\編輯于星期日

DNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。一、DNA序列測定的意義現(xiàn)在是3頁\一共有44頁\編輯于星期日

人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個(gè)）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。造福人類的HGP現(xiàn)在是4頁\一共有44頁\編輯于星期日1949年,FrederickSanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測序技術(shù),后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動(dòng)測序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測定法,并完成了大腸桿菌5SrRNA的120個(gè)核苷酸的測定。同一時(shí)期,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA的序列測定。蛋白質(zhì)和RNA的測序技術(shù)二、測序技術(shù)的建立現(xiàn)在是5頁\一共有44頁\編輯于星期日1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年，Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測定的效率和準(zhǔn)確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報(bào)道了化學(xué)降解法測定DNA的序列。DNA測序技術(shù)的建立現(xiàn)在是6頁\一共有44頁\編輯于星期日DNA序列測定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。現(xiàn)在是7頁\一共有44頁\編輯于星期日三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)現(xiàn)在是8頁\一共有44頁\編輯于星期日1、第一代DNA測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)：傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)。第一代DNA測序技術(shù)包括：化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動(dòng)測序技術(shù)和雜交測序技術(shù)?，F(xiàn)在是9頁\一共有44頁\編輯于星期日1.1化學(xué)降解法基本原理:利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測出DNA的序列。現(xiàn)在是10頁\一共有44頁\編輯于星期日

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線現(xiàn)在是11頁\一共有44頁\編輯于星期日堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)現(xiàn)在是12頁\一共有44頁\編輯于星期日現(xiàn)在是13頁\一共有44頁\編輯于星期日化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替?，F(xiàn)在是14頁\一共有44頁\編輯于星期日1.2雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該法的原理是：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列?，F(xiàn)在是15頁\一共有44頁\編輯于星期日

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH現(xiàn)在是16頁\一共有44頁\編輯于星期日雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖

現(xiàn)在是17頁\一共有44頁\編輯于星期日Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測序技術(shù)。現(xiàn)在是18頁\一共有44頁\編輯于星期日1.3熒光自動(dòng)測序技術(shù)熒光自動(dòng)測序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準(zhǔn)確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動(dòng)測序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測序儀。如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細(xì)管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記，在通過毛細(xì)管時(shí)不同長度的DNA片段上的4種熒光基團(tuán)被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。現(xiàn)在是19頁\一共有44頁\編輯于星期日目前所用自動(dòng)測序技術(shù)的改進(jìn)現(xiàn)在是20頁\一共有44頁\編輯于星期日3730

全自動(dòng)測序儀現(xiàn)在是21頁\一共有44頁\編輯于星期日1.4雜交測序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測序檢測速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。現(xiàn)在是22頁\一共有44頁\編輯于星期日通過幾十年的逐步改進(jìn),第1代測序儀的讀長可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000堿基?，F(xiàn)在是23頁\一共有44頁\編輯于星期日第一代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測序儀仍被廣泛地應(yīng)用。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代,即功能基因組時(shí)代,傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求,這促使了新一代DNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)即第二代測序技術(shù)?，F(xiàn)在是24頁\一共有44頁\編輯于星期日2、第二代DNA測序技術(shù)第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GSFLX測序平臺、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺。第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序,使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行?，F(xiàn)在是25頁\一共有44頁\編輯于星期日第二代測序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個(gè)空間固定的PCR克隆陣列。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫片段的多個(gè)拷貝組成。然后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都在同一平面上,這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行,每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測也能同時(shí)進(jìn)行,從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復(fù),最后經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

第二代測序技術(shù)包括：454測序技術(shù)、Solexa測序技術(shù)和SOLiD測序技術(shù)?，F(xiàn)在是26頁\一共有44頁\編輯于星期日2.1454測序技術(shù)

原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測DNA序列的目的。現(xiàn)在是27頁\一共有44頁\編輯于星期日現(xiàn)在是28頁\一共有44頁\編輯于星期日454生命科學(xué)公司在2005年最早推出了第二代測序平臺GenomeSequencer20，并測序了支原體Mycoplasmagenitalium的基因組。并在2007年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅氏在2005年便與454公司洽談并購事宜，2007年完成并購，緊接著公布了DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一——沃森(JimWatson)的個(gè)人基因組，測序總花費(fèi)不到一百萬美元?，F(xiàn)在是29頁\一共有44頁\編輯于星期日2.2Solexa測序技術(shù)

核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止”。原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進(jìn)行測序。Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序(SequencingbySynthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測序?，F(xiàn)在是30頁\一共有44頁\編輯于星期日GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對末端讀長可達(dá)到2×50bp，每次運(yùn)行后可獲得超過20GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代測序技術(shù)?，F(xiàn)在是31頁\一共有44頁\編輯于星期日SOLID通過連接反應(yīng)進(jìn)行測序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫準(zhǔn)備擴(kuò)增微珠與玻片連接連接測序超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基兇組覆蓋度。2.3SOLiD測序技術(shù)現(xiàn)在是32頁\一共有44頁\編輯于星期日現(xiàn)在是33頁\一共有44頁\編輯于星期日3、第三代DNA測序技術(shù)第三代測序技術(shù)是以單分子測序?yàn)樘攸c(diǎn)的測序技術(shù)。如生物科學(xué)公司(BioScienceCorporation)的HeliScope單分子測序儀(HeliScopeSingleMolecularSequencer)以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司(PacificBiosciences)的單分子實(shí)時(shí)DNA測序技術(shù)[SingleMoleculeRealTime(SMRT)DNAsequencingtechnology]和牛津納米孔技術(shù)公司(OxfordNanoporeTechnologiesLtd)的納米孔單分子測序技術(shù)等?，F(xiàn)在是34頁\一共有44頁\編輯于星期日

目前,我國也啟動(dòng)了第三代測序技術(shù)的研究。2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”,利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀,第一臺樣機(jī)預(yù)計(jì)2013年問世,屆時(shí)有望緩解測序儀核心技術(shù)受制于國外公司的現(xiàn)狀。第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用,但是由于其測序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。單分子測序也就應(yīng)運(yùn)而生?，F(xiàn)在是35頁\一共有44頁\編輯于星期日第三代測序技術(shù)非常驚人！1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4、可直接測RNA序列。5、可直接測甲基化的DNA序列?，F(xiàn)在是36頁\一共有44頁\編輯于星期日

2008年4月，HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù),并利用該技術(shù)對一個(gè)M13病毒基因組進(jìn)行重測序。這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序,是因?yàn)樗耆邕^了前述3種高通量測序依賴的基于PCR擴(kuò)增的信號放大過程,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用Heliscope單分子測序儀,用了48000美元的試劑和4個(gè)星期的時(shí)間,對一名白人男子的基因組進(jìn)行了測序。測序的覆蓋度達(dá)28倍,覆蓋了90%的人類參考基因組。序列讀長24-70bp,平均讀長為32bp,并鑒定出280萬個(gè)SNP位點(diǎn)和752個(gè)拷貝數(shù)變異。3.1HeliScope單分子測序儀現(xiàn)在是37頁\一共有44頁\編輯于星期日Pacificbioscience在Science上報(bào)道了他們的基于SMART技術(shù)的單分子測序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶,在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測序產(chǎn)物,目前一期的讀取速度為3bp/s,但他們聲稱在2013前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。Pacific技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評價(jià)讀長為586個(gè)堿基,有些能達(dá)到2805堿基,新儀器的單個(gè)讀長已達(dá)10351個(gè)堿基,而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長,而且準(zhǔn)確率＞99.9999%。3.2單分子實(shí)時(shí)DNA測序技術(shù)現(xiàn)在是38頁\一共有44頁\編輯于星期日英國牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分子測序技術(shù),該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快,而且成本會大大降低。在該測序技術(shù)平臺中,DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過納米小孔,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNA堿基,同時(shí)還能檢測出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息。3.3納米孔單分子測序技術(shù)現(xiàn)在是39頁\一共有44頁\編輯于星期日據(jù)2010年7月30日XiaoYan（NanoLett，July30，2010）報(bào)道，美國賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員開發(fā)出一個(gè)納米級的碳基平臺，可用于電子探測單個(gè)DNA分子。該技術(shù)最終有望在快速DNA電子測序方面發(fā)揮“用武之地”。這個(gè)納米平臺由石墨烯制成。研究小組利用電子束技術(shù)，在石墨烯膜上燒灼出納米大小的小孔，在電場的作用下，微小的DNA鏈就可以穿過這些孔洞。通過電子測量手段檢測DNA的易位，再根據(jù)DNA的4個(gè)堿基各自獨(dú)特的“電子簽名”，就可以快速完成DNA測序。探測單個(gè)DNA分子技術(shù)開啟高通量DNA電