葉綠體色素的提取、分離及含量測定

葉綠體色素的提取、分離及含量測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜~綠素是植物吸收太陽光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要有葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠素a與葉綠素b是高等植物葉綠體色素的重要組分，約占到葉綠體色素總量的75%左右。葉綠素在光合作用中起到吸收光能、傳遞光能的作用（少量的葉綠素a還具有光能轉(zhuǎn)換的作用），因此葉綠素的含量與植物的光合速率密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，光合速率隨葉綠素含量的增加而升高。另外，葉綠素的含量是植物生長狀態(tài)的一個(gè)反映，一些環(huán)境因素如干旱、鹽漬、低溫、大氣污染、元素缺乏都可以影響葉綠素的含量與組成，并因之影響植物的光合速率。因此葉綠素含量a與葉綠素b含量的測定對植物的光合生理與逆境生理具有重要意義。實(shí)驗(yàn)原理從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對其認(rèn)識和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機(jī)溶劑的特性，可用95%乙醇提取。分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等。紙層析是其中最簡單的一種。當(dāng)溶劑不斷地從層析濾紙上流過時(shí)，由于混合色素中各種成分在兩相（即流動相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，它們的移動速度不同，使樣品中的各種成分得到分離。強(qiáng)光可以破壞離體的葉綠素，因?yàn)橹参矬w內(nèi)本來有還原酶，可以破壞光產(chǎn)生的強(qiáng)氧化物質(zhì)。而離體的葉綠素提取液中不含有還原酶，光產(chǎn)生的強(qiáng)氧化物質(zhì)會破壞葉綠素。葉綠素提取液中同時(shí)含有葉綠素a和葉綠素b,二者的吸收光譜雖有不同，但又存在著明顯的重疊，在不分離葉綠素a和葉綠素b的情況下同時(shí)測定葉綠素a和葉綠素b的濃度，可分別測定在663nm和645nm（分別是葉綠素a和葉綠素b在紅光區(qū)的吸收峰）的光吸收，然后根據(jù)Lambert-Beer定律，計(jì)算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的濃度。A663=82.04Ca+9.27Cb （1）A645=16.75Ca+45.60Cb(2)公式中Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉綠素b濃度（單位為g/L）,82.04和9.27分別是葉綠素a和葉綠素b在663nm下的比吸收系數(shù)（濃度為1g/L,光路寬度為1cm時(shí)的吸光度值）；16.75和45.60分別是葉綠素a和葉綠素b在645nm下的比吸收系數(shù)。即混合液在某一波長下的光吸收等于各組分在此波長下的光吸收之和。將上式整理，可以得到下式：TOC\o"1-5"\h\zCa=0.0127A663-0.00269A645 （3）Cb=0.0229A645-0.00468A663 （4）將葉綠素的濃度改為mg/L,則上式變?yōu)椋篊a=12.7A663-2.69A645 （5）Cb=22.9A645-4.68A663 （6）CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 （7）CT為葉綠素的總濃度。材料、器材與試劑植物材料：從校園內(nèi)采集的新鮮南瓜綠葉器材：臺秤、研缽、剪刀、量筒、漏斗、燒杯、濾紙、吸耳球、移液管、培養(yǎng)皿、電吹風(fēng)、毛細(xì)管、分光光度計(jì)試劑：95%乙醇、碳酸鈣、汽油、苯、KOH、甲醇、醋酸銅、鹽酸實(shí)驗(yàn)步驟葉綠體色素的提取與分離：稱取新鮮南瓜葉片2g,剪碎放入研缽中，加入乙醇5ml、少許CaCO3（中和細(xì)胞中的酸防止Mg2+從葉綠素中心釋放），研磨成勻漿，再加入適量的乙醇（5-10ml）,然后用漏斗過濾，即得葉綠體色素液。取準(zhǔn)備好的濾紙條（2*20cm）,用毛細(xì)管吸取葉綠體色素提取液涂于濾紙的下端寬條，注意下一次所點(diǎn)溶液不可過多，用電吹風(fēng)吹干后再重復(fù)3次。將濾紙條卷成棒狀。取圓濾紙?jiān)谄渲虚g剪開一個(gè)小圓孔，將棒狀紙條涂有葉綠素的一端插入濾紙圓孔內(nèi)，并將濾紙條豎立與培養(yǎng)皿中。向培養(yǎng)皿中加入層析液（石油醚:丙酮:苯為20:2:1的混合溶液）。經(jīng)0.5-1h后，觀察分離后色素帶的分布。最上端橙黃色的是胡蘿卜素，其次為葉黃素，于下面藍(lán)綠色為葉綠素a,最后的黃綠色為葉綠素b.葉綠素含量的測定①提取葉綠素于天平上稱取0.5g新鮮南瓜葉片，剪碎后置于研體中，加入5ml乙醇（95％），少許CaCO3。仔細(xì)研磨成勻漿，用濾斗過濾到10ml量筒中，注意在研缽中加入少量95%乙醇將研缽洗凈，一并轉(zhuǎn)入研缽中過濾到量筒內(nèi)，并定容至10ml。將量筒內(nèi)的提取液混勻，用移液管小心抽取5ml轉(zhuǎn)入25ml量筒中，再加入95%乙醇定容至25ml（最終植物材料與提取液的比例為W：V=0.5：50=1：100）。②測量光吸收645nm和利用722分光光度計(jì)或UV1700分光光度計(jì)，分別測定葉綠素提取液在663nm645nm和實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析葉綠素含量的測定：A663=0.992A645=0.401Ca=12.7*0.992-2.69*0.401=11.520（mg/L）Cb=22.9*0.401-4.68*0.992=4.550（mg/L）CT=Ca+Cb=8.02*0.992+20.21*0.401=16.060（mg/L）最后要計(jì)算出單位葉片鮮重中葉綠素的含量：葉綠素a含量（mg/g鮮重）=Cax50ml（總體積數(shù)）X1ml/1000ml/L=0.5g=1.152葉綠素b含量（mg/g鮮重）=0.455總?cè)~綠素含量（mg/g鮮重）=1.606葉綠素的分布：

類胡蘿卜素葉黃素葉綠素a葉綠素b思考討論1．葉綠素在藍(lán)光區(qū)的吸收峰高于紅光區(qū)的吸收峰，為何不用藍(lán)光區(qū)的光吸收來測定葉綠素的含量？答：葉綠素在可見光區(qū)有兩個(gè)最強(qiáng)的吸收區(qū)：紅光區(qū)(640nm~660nm)和藍(lán)紫光區(qū)(430nm~450nm)。葉黃素與胡蘿卜素的吸收光區(qū)與葉綠素不同，它們的最大吸收帶在藍(lán)紫光區(qū)，不吸收紅光區(qū)的長波。所以，盡管葉綠素的最大吸收光區(qū)在藍(lán)紫區(qū)，為了減少葉黃素和胡蘿卜素在葉綠素的OD值測量時(shí)的影響，選擇用紅光區(qū)來測量葉綠素含量。2.計(jì)算葉綠素a與葉綠素b含量的比值，可以得到什么結(jié)論？答：葉綠素a含量(mg/g鮮重)/葉綠素b含量(mg/g鮮重)=1.006/0.611=1.65。由計(jì)算結(jié)果可知，所采取的南瓜嫩葉中葉綠素a含量比葉綠素b的含量要高?？赡苁且?yàn)椋~綠素a、b在光合作用中起到吸收光能、傳遞光能的作用，而少量的葉綠素a還具有光能轉(zhuǎn)換的作用，所以葉綠素a含量比葉綠素b的含量要高。3.比較陽生植物和陰生植物的葉綠素a和葉綠素b的含量以及比例，可以得到什么結(jié)論？答：在陰生植物中葉綠素a與葉綠素b的含量要高于陽生植物中的含量