細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇改進(jìn)

細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇改進(jìn)第1頁/共21頁細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇第2頁/共21頁細(xì)胞的凍存的必要性第3頁/共21頁凍存的原理為使細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)存活率最高最佳的凍存條件：盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成，減小細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的低溫?fù)p傷。A)緩慢冷凍B)用親水的低溫保護(hù)劑排除水分C)在盡可能低的溫度保存細(xì)胞D)快速復(fù)蘇第4頁/共21頁1.緩慢冷凍：大部分培養(yǎng)細(xì)胞以1oC/min降溫時(shí)冷凍存活率最高。常用方法

4oC離心收集細(xì)胞細(xì)胞在冷的凍存液中懸浮冰上5min-20oC冰箱30min-80oC冰箱過夜液氮罐長期保存2.用親水的低溫保護(hù)劑排除水分在凍存液中加入細(xì)胞保護(hù)劑甘油或DMSO（二甲基亞砜）后進(jìn)行冷凍。DMSO相對(duì)于甘油而言：穿透細(xì)胞的能力強(qiáng)，保護(hù)作用好。但有一定毒性，對(duì)某些細(xì)胞可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化。第5頁/共21頁細(xì)胞凍存所用培養(yǎng)基細(xì)胞生長用培養(yǎng)基細(xì)胞凍存用培養(yǎng)基RPMI-164059%碳酸氫鈉青、鏈霉素1%血清（FBS）30%DMSO10%第6頁/共21頁以較高的細(xì)胞濃度凍存細(xì)胞，細(xì)胞的存活率會(huì)高一些。第7頁/共21頁用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞目的：量化細(xì)胞的濃度應(yīng)用：傳代中標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞的濃度；

第8頁/共21頁生存率的檢測(cè)檢測(cè)潛在的損傷基于細(xì)胞膜的完整性被破壞最常用的是“染料排斥法測(cè)定細(xì)胞生存率”常用染料為：臺(tái)盼藍(lán)、藻紅和萘黑注意：染料與細(xì)胞混合后不要放置很久（5-10min），否則活細(xì)胞會(huì)受到損傷而吸收染料。第9頁/共21頁將細(xì)胞懸液滴到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室的邊緣，蓋上蓋玻片；（利用毛細(xì)作用使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間的空隙。小室內(nèi)的液體既不能多，也不能少）2.把計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡載物臺(tái)上；3.選擇一個(gè)10X的物鏡，利用網(wǎng)格線對(duì)焦；4.移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使鏡下的視野恰好是整個(gè)網(wǎng)格區(qū)域中心的一個(gè)大方格（1mm2）1mm第10頁/共21頁5.為了避免重復(fù)計(jì)算，壓線的細(xì)胞只計(jì)算左線和上線者，右線和下線不計(jì)算在內(nèi)。計(jì)數(shù)的細(xì)胞越多，計(jì)算的結(jié)果越準(zhǔn)確。若要進(jìn)行需精確定量的實(shí)驗(yàn)，所數(shù)的細(xì)胞數(shù)應(yīng)在500~1000個(gè)。

（a）如果視野內(nèi)的細(xì)胞過少（<100/mm2），需要額外計(jì)算中心大方格周圍的一個(gè)或多個(gè)大方格（每個(gè)方格1mm2）。

（b）如果視野內(nèi)的細(xì)胞過多（>1000/mm2），只需計(jì)算大方格（1mm2）對(duì)角線上的小方格。

第11頁/共21頁細(xì)胞樣品濃度的計(jì)算計(jì)算公式：C=n/vC是細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml)n是數(shù)過的細(xì)胞數(shù)v是被計(jì)數(shù)的細(xì)胞體積（ml）血細(xì)胞計(jì)數(shù)室通常是1mm2X0.1mm深為1X10-4ml最終公式為：C=nX104同時(shí)需要考慮懸浮細(xì)胞所用的總的ml數(shù)和樣本的稀釋倍數(shù)。第12頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟

（細(xì)胞凍存）第13頁/共21頁用品器材

超凈工作臺(tái)內(nèi)：（共享）污物缸1個(gè)、酒精燈2個(gè)、酒精棉球1瓶、大鑷子1把、打火機(jī)1個(gè)、微量移液器和槍頭（5ml、1ml和50ul各一）（每人）空EP管2個(gè)、1640培養(yǎng)基（0.75ml）、胰酶（0.75ml）、Hank’s液（H，1ml）、凍存液（錫紙，1ml）、凍存管1只、無菌袖套教室：槍頭（50ul）、0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片教室對(duì)面：離心機(jī)第14頁/共21頁本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟一（每人做一份）操作臺(tái)內(nèi)去除培養(yǎng)基，1mlHanks洗細(xì)胞，再用胰酶（0.9ml）消化細(xì)胞；（如何？）加入0.9ml完全培養(yǎng)基中止消化；吹打；（充分地混勻細(xì)胞懸液使之盡量分散成單個(gè)細(xì)胞；盡量減少氣泡的產(chǎn)生）轉(zhuǎn)入空2mlEP管（A）；從中取20ul細(xì)胞懸浮液，放入另一個(gè)1.5mlEP管（B）；兩只EP管蓋好后，拿出無菌操作臺(tái)；EP管做好標(biāo)記無菌操作室教室對(duì)面:

將EP管（A）配平后，放入離心機(jī)，4oC，1000g，10min離心第15頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟二無菌操作室將EP管A離心后，小心帶回?zé)o菌操作臺(tái)，去上清；余下的細(xì)胞沉淀，加入0.5ml細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管；凍存管上做好標(biāo)記；放入無菌準(zhǔn)備間中的冰盒5min；放入-20oC，30min；放入-80oC過夜；液氮長期保存。教室EP管B：在20ul細(xì)胞懸浮液中加入20ul0.4%TrypanBlue,快速混合后，取20ul滴在血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)小室上方，蓋上蓋玻片，開始計(jì)數(shù)；計(jì)算出細(xì)胞懸浮液的濃度，細(xì)胞生存率（實(shí)驗(yàn)報(bào)告上應(yīng)有的數(shù)據(jù)）去蓋玻片，將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈交老師。第16頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟

（凍存細(xì)胞的復(fù)蘇）第17頁/共21頁第18頁/共21頁用品器材

超凈工作臺(tái)內(nèi)：（共享）污物缸1個(gè)、酒精燈2個(gè)、酒精棉球1瓶、大鑷子1把、打火機(jī)1個(gè)、5ml移液器及槍頭、槍架、1640培養(yǎng)基（每人）培養(yǎng)瓶、無菌袖套第19頁/共21頁本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟一

（每人做一份）取凍存管（在干冰上，請(qǐng)注意安全?。?7oC水浴3