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細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇改進(jìn)第1頁/共21頁細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇第2頁/共21頁細(xì)胞的凍存的必要性第3頁/共21頁凍存的原理為使細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)存活率最高最佳的凍存條件:盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成,減小細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的低溫?fù)p傷。A)緩慢冷凍B)用親水的低溫保護(hù)劑排除水分C)在盡可能低的溫度保存細(xì)胞D)快速復(fù)蘇第4頁/共21頁1.緩慢冷凍:大部分培養(yǎng)細(xì)胞以1oC/min降溫時(shí)冷凍存活率最高。常用方法
4oC離心收集細(xì)胞細(xì)胞在冷的凍存液中懸浮冰上5min-20oC冰箱30min-80oC冰箱過夜液氮罐長期保存2.用親水的低溫保護(hù)劑排除水分在凍存液中加入細(xì)胞保護(hù)劑甘油或DMSO(二甲基亞砜)后進(jìn)行冷凍。DMSO相對(duì)于甘油而言:穿透細(xì)胞的能力強(qiáng),保護(hù)作用好。但有一定毒性,對(duì)某些細(xì)胞可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化。第5頁/共21頁細(xì)胞凍存所用培養(yǎng)基細(xì)胞生長用培養(yǎng)基細(xì)胞凍存用培養(yǎng)基RPMI-164059%碳酸氫鈉青、鏈霉素1%血清(FBS)30%DMSO10%第6頁/共21頁以較高的細(xì)胞濃度凍存細(xì)胞,細(xì)胞的存活率會(huì)高一些。第7頁/共21頁用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞目的:量化細(xì)胞的濃度應(yīng)用:傳代中標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞的濃度;
第8頁/共21頁生存率的檢測(cè)檢測(cè)潛在的損傷基于細(xì)胞膜的完整性被破壞最常用的是“染料排斥法測(cè)定細(xì)胞生存率”常用染料為:臺(tái)盼藍(lán)、藻紅和萘黑注意:染料與細(xì)胞混合后不要放置很久(5-10min),否則活細(xì)胞會(huì)受到損傷而吸收染料。第9頁/共21頁將細(xì)胞懸液滴到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室的邊緣,蓋上蓋玻片;(利用毛細(xì)作用使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間的空隙。小室內(nèi)的液體既不能多,也不能少)2.把計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡載物臺(tái)上;3.選擇一個(gè)10X的物鏡,利用網(wǎng)格線對(duì)焦;4.移動(dòng)計(jì)數(shù)板,使鏡下的視野恰好是整個(gè)網(wǎng)格區(qū)域中心的一個(gè)大方格(1mm2)1mm第10頁/共21頁5.為了避免重復(fù)計(jì)算,壓線的細(xì)胞只計(jì)算左線和上線者,右線和下線不計(jì)算在內(nèi)。計(jì)數(shù)的細(xì)胞越多,計(jì)算的結(jié)果越準(zhǔn)確。若要進(jìn)行需精確定量的實(shí)驗(yàn),所數(shù)的細(xì)胞數(shù)應(yīng)在500~1000個(gè)。
(a)如果視野內(nèi)的細(xì)胞過少(<100/mm2),需要額外計(jì)算中心大方格周圍的一個(gè)或多個(gè)大方格(每個(gè)方格1mm2)。
(b)如果視野內(nèi)的細(xì)胞過多(>1000/mm2),只需計(jì)算大方格(1mm2)對(duì)角線上的小方格。
第11頁/共21頁細(xì)胞樣品濃度的計(jì)算計(jì)算公式:C=n/vC是細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)/ml)n是數(shù)過的細(xì)胞數(shù)v是被計(jì)數(shù)的細(xì)胞體積(ml)血細(xì)胞計(jì)數(shù)室通常是1mm2X0.1mm深為1X10-4ml最終公式為:C=nX104同時(shí)需要考慮懸浮細(xì)胞所用的總的ml數(shù)和樣本的稀釋倍數(shù)。第12頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟
(細(xì)胞凍存)第13頁/共21頁用品器材
超凈工作臺(tái)內(nèi):(共享)污物缸1個(gè)、酒精燈2個(gè)、酒精棉球1瓶、大鑷子1把、打火機(jī)1個(gè)、微量移液器和槍頭(5ml、1ml和50ul各一)(每人)空EP管2個(gè)、1640培養(yǎng)基(0.75ml)、胰酶(0.75ml)、Hank’s液(H,1ml)、凍存液(錫紙,1ml)、凍存管1只、無菌袖套教室:槍頭(50ul)、0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片教室對(duì)面:離心機(jī)第14頁/共21頁本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟一(每人做一份)操作臺(tái)內(nèi)去除培養(yǎng)基,1mlHanks洗細(xì)胞,再用胰酶(0.9ml)消化細(xì)胞;(如何?)加入0.9ml完全培養(yǎng)基中止消化;吹打;(充分地混勻細(xì)胞懸液使之盡量分散成單個(gè)細(xì)胞;盡量減少氣泡的產(chǎn)生)轉(zhuǎn)入空2mlEP管(A);從中取20ul細(xì)胞懸浮液,放入另一個(gè)1.5mlEP管(B);兩只EP管蓋好后,拿出無菌操作臺(tái);EP管做好標(biāo)記無菌操作室教室對(duì)面:
將EP管(A)配平后,放入離心機(jī),4oC,1000g,10min離心第15頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟二無菌操作室將EP管A離心后,小心帶回?zé)o菌操作臺(tái),去上清;余下的細(xì)胞沉淀,加入0.5ml細(xì)胞凍存液,使細(xì)胞懸浮,轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管;凍存管上做好標(biāo)記;放入無菌準(zhǔn)備間中的冰盒5min;放入-20oC,30min;放入-80oC過夜;液氮長期保存。教室EP管B:在20ul細(xì)胞懸浮液中加入20ul0.4%TrypanBlue,快速混合后,取20ul滴在血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)小室上方,蓋上蓋玻片,開始計(jì)數(shù);計(jì)算出細(xì)胞懸浮液的濃度,細(xì)胞生存率(實(shí)驗(yàn)報(bào)告上應(yīng)有的數(shù)據(jù))去蓋玻片,將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈交老師。第16頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟
(凍存細(xì)胞的復(fù)蘇)第17頁/共21頁第18頁/共21頁用品器材
超凈工作臺(tái)內(nèi):(共享)污物缸1個(gè)、酒精燈2個(gè)、酒精棉球1瓶、大鑷子1把、打火機(jī)1個(gè)、5ml移液器及槍頭、槍架、1640培養(yǎng)基(每人)培養(yǎng)瓶、無菌袖套第19頁/共21頁本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟一
(每人做一份)取凍存管(在干冰上,請(qǐng)注意安全?。?7oC水浴3
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