聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì)第1頁/共42頁

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉電泳的基本原理2、掌握PAGE的基本原理與操作技術(shù)第2頁/共42頁具體安排上午:制膠、原理講解中午：電泳（午餐）下午：染色，脫色、觀察結(jié)果第3頁/共42頁電泳的基本原理電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶相反電荷的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。應(yīng)用:

蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸等物質(zhì)的分離和鑒定。第4頁/共42頁

帶電粒子的運(yùn)動(dòng)速度遷移率μ

即帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。

μ

=QX

/6πrηQ粒子所帶電荷量X電場(chǎng)強(qiáng)度r粒子半徑η介質(zhì)的粘度第5頁/共42頁

影響電泳速度的因素1、內(nèi)在因素:樣品自身性質(zhì)2、外在因素:電場(chǎng)緩沖液支持介質(zhì)第6頁/共42頁a.電荷b.分子大小c.形狀v=QX/6πrη

內(nèi)因：待分離大分子的性質(zhì)第7頁/共42頁

電場(chǎng)（三要素）電流：μ與電流成正比電壓：μ與電壓成正比常壓電泳（100-500V）高壓電泳（500-10000V）電阻：μ與電阻成反比第8頁/共42頁緩沖液

pH：為電泳提供了恒定的pH值和適宜的離子強(qiáng)度解離性質(zhì)解離程度運(yùn)動(dòng)方向電荷量一般所用離子強(qiáng)度為0.02-0.2之間離子強(qiáng)度：強(qiáng)度過低，緩沖能力差，難以維持pH恒定，同時(shí)樣品擴(kuò)散嚴(yán)重；

強(qiáng)度過高，減緩樣品的遷移率。第9頁/共42頁支持介質(zhì)（物）吸附:支持介質(zhì)對(duì)樣品的滯留作用,可導(dǎo)致樣品的拖尾。電滲：在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆粒泳動(dòng)速度；反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減慢顆粒泳動(dòng)速度。分子篩：是凝膠電泳的一個(gè)特性。篩孔越小，則顆粒在移動(dòng)的過程中所受到的阻力也就越大。

第10頁/共42頁電泳分類按支持介質(zhì)的不同可分為

⑴紙電泳⑵醋酸纖維薄膜電泳

⑶瓊脂糖凝膠電泳

⑷聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

⑸SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳第11頁/共42頁P(yáng)AGE實(shí)驗(yàn)原理第12頁/共42頁

N，N'－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)單體交聯(lián)劑催化劑加速劑

丙烯酰胺(Acr)過硫酸銨/核黃素

N，N，N‘，N’－四甲基乙二胺（TEMED）聚丙烯酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N，－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑和加速劑的作用下聚合而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。第13頁/共42頁丙烯酰胺(Acr)N，N'－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)第14頁/共42頁分類（根據(jù)有無濃縮效應(yīng)）連續(xù)電泳：電泳體系中緩沖液組成、pH值及凝膠孔徑大小都相同。

電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)不連續(xù)電泳：電泳體系中緩沖液組成、pH值及凝膠孔徑大小都不相同。

電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)第15頁/共42頁不連續(xù)電泳分離膠濃縮膠電極緩沖液凝膠孔徑小大——緩沖體系離子組成Tris-HClTris-HClTris-GlypH值8.96.78.3第16頁/共42頁濃縮效應(yīng)濃縮膠,大孔膠,Tris-HCl,pH6.71.凝膠孔徑的不連續(xù)性2.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

快離子(前導(dǎo)離子):氯離子Cl-

慢離子(尾隨離子):甘氨酸根NH2CH2COO-樣品中蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度介于這兩種離子之間3.電位梯度的不連續(xù)性__

+Tris/甘氨酸pH8.3Tris/HClpH8.9第17頁/共42頁分子篩效應(yīng)分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，其受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。電荷效應(yīng)進(jìn)入pH8.9的分離膠中,各種蛋白質(zhì)所帶凈電荷量不同而有不同的遷移率。表面電荷多,則遷移快;反之,則慢.分離膠（小孔膠）pH8.9分離膠,濃縮膠第18頁/共42頁實(shí)驗(yàn)操作第19頁/共42頁一、制膠(本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟)1、安裝玻板：將洗凈的、帶白色邊條的玻板水平放好，將U型硅膠密封條擺好。然后，將不帶邊條的短玻板蓋在U型硅膠密封條上。第20頁/共42頁2、安裝鐵夾：用4只鐵夾將安裝好的玻板夾好。注意：1）夾子的作用點(diǎn)應(yīng)和白色邊條重合，避免夾到邊條內(nèi)側(cè)，造成玻板變形。

2）玻板下沿的兩個(gè)夾子盡量下移，使之能夠起到“腿”的作用，保證玻板處于直立狀態(tài)。第21頁/共42頁3、配制聚丙烯酰胺凝膠:每種試劑用相應(yīng)的吸量管、滴管來吸，吸量管上有標(biāo)記。

不可混用，否則污染試劑，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第22頁/共42頁分離膠的配制小燒杯中按下列順序加入：（B液有毒性，盡量不要接觸到皮膚）1——A液（Tris-HCl）1ml2——B液（Acr-Bis）2ml3——蒸餾水1ml4——過硫酸銨(現(xiàn)配）5ml前面四項(xiàng)加完后，混勻5——TEMED1滴（是加速劑，加入后很快就會(huì)凝固，所以最后加，加完后稍事混勻就灌注）第23頁/共42頁

灌注分離膠將配制好的分離膠輕輕混勻，注意不要產(chǎn)生氣泡快速倒入電泳槽兩玻璃板之間的縫隙中，不要產(chǎn)生氣泡。液面高度應(yīng)距離短玻璃板上緣約2-3厘米左右，上面灌制濃縮膠。灌制完成，放于水平處不要再動(dòng)，約15-20分鐘可以聚合（聚合時(shí)間與室溫和加樣準(zhǔn)確度有關(guān)）。燒杯中的膠不要扔掉（化學(xué)聚合）聚膠過程講理論第24頁/共42頁

另一小燒杯中按下列順序加入：（D液有毒性，盡量不要接觸到皮膚）1——C液（Tris-HCl）0.4ml2——D液（Acr-Bis）0.8ml3——E液(核黃素）0.3ml4——過硫酸銨0.6ml5——蒸餾水0.9ml

混勻6——TEMED1-2滴

濃縮膠的配制第25頁/共42頁

輕輕混勻，快速傾倒進(jìn)玻璃板間的縫隙,液面高度與矮板相平。插入樣品槽模板（又稱梳子），不要帶進(jìn)氣泡。整個(gè)裝置在紫外線下照射30分鐘，使?jié)饪s膠充分聚合（光聚合）。

灌制濃縮膠聚膠過程講理論第26頁/共42頁

每四組配制一份，再分裝成4小份即可。1——血清0.3ml

（吸血清的吸量管用后要馬上清洗，以免堵塞）2——C液1.0ml3——20%或40%的蔗糖3.0ml4——0.05%溴芬蘭0.4ml（思考2：為什么加2、3、4這三種液體？）

配制樣品液第27頁/共42頁

安裝電泳槽,加入電極緩沖液（F液）1.除去夾子及密封硅膠條,將玻璃夾板、電泳槽內(nèi)芯、有機(jī)玻璃平板依次放入槽內(nèi)。(注意：兩玻璃夾板的矮板應(yīng)與電泳槽內(nèi)芯接觸。)然后插入楔型板以固定玻璃夾板。2.

在外水槽加電泳緩沖液（F液）至槽體一半的位置，傾斜槽體，使玻璃夾板下沿中的氣泡逸出。放正槽體，繼續(xù)加注緩沖液，使內(nèi)外槽F液的水位均超過矮板，但不能超過高板。3.

將梳子輕輕取出，讓F液進(jìn)入梳子形成的加樣槽中，準(zhǔn)備加樣品。第28頁/共42頁第29頁/共42頁第30頁/共42頁加樣:加樣器針尖貼著高玻璃板伸到加樣槽中間位置加樣，針尖不要扎破下面的膠面。加樣量:10ul-50ul加樣第31頁/共42頁第32頁/共42頁

電泳

1)加樣完畢后，將電泳槽蓋好蓋，與電泳儀相連接。

2)電泳儀電壓調(diào)至最大，電流調(diào)到最小，打開電泳儀開關(guān)進(jìn)行恒流電泳。3)濃縮膠:30mA(150V)分離膠:40mA(200V)加樣后馬上將微量加樣器仔細(xì)沖洗多遍，以免血清堵塞針尖。

第33頁/共42頁第34頁/共42頁第35頁/共42頁

觀察并記錄電泳現(xiàn)象第36頁/共42頁剝膠：拆開電泳槽裝置，用竹鑷子輕輕撬開兩層玻璃板，戴上一次性手套，用手和鑷子將分離膠剝離到染色液盤內(nèi)，染色15分鐘。脫色：將分離膠小心完整地從染色液中移到脫色液內(nèi)，脫色三次，每次10分鐘（每次更換新鮮脫色液80-100ml），脫色時(shí)在搖床上搖。

八、剝膠、染色、脫色第37頁/共42頁第38頁/共42頁

點(diǎn)樣線

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清