胚胎試驗在水生動物中的應用

胚胎試驗在水生動物中的應用第1頁/共49頁建立靈敏、簡便易行的檢測方法急性暴露試驗雖然簡便易行，但是其檢測指標過于簡單。各種慢性毒性試驗雖然提供多個檢測終點，但存在實驗周期長、費用高等不足。而水生生物胚胎試驗具有成本低、影響因素少、靈敏度高等方面的優(yōu)勢，受試物種也由最初的魚類向多樣化發(fā)展，其應用日益廣泛。第2頁/共49頁魚類成體和胚胎試驗靈敏度比較第3頁/共49頁胚胎試驗胚胎試驗是又稱胚胎毒性試驗或胚胎致畸試驗，指通過把胚胎暴露于受試化學物質而受到毒害作用，繼而影響胚胎的發(fā)育、導致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。廣義上的胚胎試驗包括所有以胚胎為材料的生物學試驗，其內容涵蓋形態(tài)學、發(fā)育學、毒理學、行為學等方面。第4頁/共49頁魚類

魚類因具有繁殖力高、體外產卵、體外受精等生殖特性成為胚胎試驗的最主要材料。第5頁/共49頁用于胚胎試驗的一些種類第6頁/共49頁斑馬魚

在實驗室內對單一物質的毒性評價往往使用特定的種類，斑馬魚是其中一個重要代表。歐洲和美國都有已經(jīng)建立的標準方法。第7頁/共49頁Zebrafish(Daniorerio)第8頁/共49頁第9頁/共49頁甲殼類——草蝦

草蝦屬廣鹽性甲殼動物(3-31ppt)。分布廣(遍布美國東海岸和墨西哥灣的廣大河口)。個體小，只要水溫，光照條件適宜，成體在實驗室容易繁殖，只需分離不同發(fā)育階段的胚胎即可用于試驗。盡管雌體產卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎離體后同樣可以正常發(fā)育至孵化，卵外被膜、胚胎透明而易于觀察形態(tài)異常。第10頁/共49頁Grassshrimp(Palaemonetespugio)第11頁/共49頁第12頁/共49頁Grassshrimp(Palaemonetespugio)第13頁/共49頁其它動物

TheFrogEmbryoTeratogenesisAssay-Xenopus(FETAX)——爪蟾ASTME1563-98:StandardguideforConductingStaticAcutetoscicityTestswithEchinoidEmbryos——海膽

第14頁/共49頁Medaka(Oryziaslatipes)第15頁/共49頁Bluecrab(Callinectessapidus)第16頁/共49頁試驗動物的選取被廣泛利用在實驗室內容易大量培養(yǎng)具有代表性和對受試物的敏感性遺傳背景清楚試驗動物的飼養(yǎng)也有相應的規(guī)范第17頁/共49頁胚胎來源多數(shù)魚類產卵后離體孵化，易于收集。一般可采用親魚人工催產結合人工受精的方法獲得。對于如斑馬魚，青鳉等小型種類，在實驗室內養(yǎng)殖相對容易，只需控制適當?shù)奈锢項l件，一般都能在試驗當天取到足夠數(shù)量的受精卵。第18頁/共49頁野外試驗收集魚卵在實驗室完成剩余的發(fā)育過程，檢測多個終點指標。原位暴露在室內得到受精卵，用適當?shù)难b置放置于待檢測的地點，全部發(fā)育過程或絕大部分發(fā)育過程在野外完成。有抱卵習性的甲殼動物，胚胎在母體腹部附肢發(fā)育成幼體，通過捕撈帶卵的母體，分離胚胎。第19頁/共49頁分類胚胎試驗同樣可分成急性毒性試驗和亞急性毒性試驗。急性毒性試驗時間較短，其目的是獲得有關受試物的初步毒性信息；亞急性毒性試驗時間較長，可以貫穿胚胎發(fā)育的整個時期。暴露途徑可分為靜態(tài)，半靜態(tài)和流動等，或微注射的途徑。第20頁/共49頁容器透明的試驗容器通常是首選，燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管是最普通的工具。在野外暴露試驗中，有黏性的受精卵可以被直接負在載玻片上，后者固定在特制的容器里。第21頁/共49頁第22頁/共49頁第23頁/共49頁溶劑有機物質水溶性較差，則需要化學溶劑來助溶，但不適當?shù)娜軇绊懡Y果的可靠性，化學溶劑本身對胚胎具有毒性甚至會和受試物產生協(xié)同作用，因此，選用適當?shù)娜軇┮约斑m當?shù)臐舛葘Y果的準確性都是有益的。乙醇，丙酮，二甲亞砜是常用的溶劑，終濃度一般在0.1%以下。第24頁/共49頁0.5%(V/V)乙醇1%(V/V)乙醇對照Grassshrimp(Palaemonetespugio)第25頁/共49頁檢測終點半致死濃度（LC50）形態(tài)異常孵化延遲生化指標遺傳物質生長指標第26頁/共49頁半致死濃度（LC50）

半致死濃度（LC50）死亡是檢測的可見終點，初步反映受試物的毒性，是急性毒性試驗的常用指標。孵化也可作為終點來反映受試物毒性，指標采用半效應濃度（EC50）。在發(fā)育早期可以胚胎完整性來判斷存活與否，當器官出現(xiàn)后則用器官的運動作為標準。第27頁/共49頁形態(tài)異常

形態(tài)異常是胚胎致畸試驗的核心內容。斑馬魚和爪蟾胚胎發(fā)育過程中有多種可以觀察的反應指標，被列入標準方法的觀察終點。對于甲殼動物，常見的觀察結構有眼、卵黃形狀、心臟、頭部、肝胰腺。發(fā)育異常往往會導致導致終止發(fā)育或發(fā)育延遲，進而推遲孵化時間。第28頁/共49頁第29頁/共49頁第30頁/共49頁B=brain;C=chorda;Ch=chorion;E=ear;Ed=edema;Eud=earunderdeveloped;Ey=eye;Eyud=eyeunderdeveloped;NC=negativecontrol;Tnd=tailnotdetached;woEy=withouteyes;woH=withouthead;woS=withoutsomites第31頁/共49頁Catfish(Clariasgariepinus)

對照Cd和Cu第32頁/共49頁1%(V/V)乙醇對照Grassshrimp(Palaemonetespugio)第33頁/共49頁孵化延遲Grassshrimp(Palaemonetespugio)第34頁/共49頁生化指標

隨著胚胎發(fā)育的深入，器官逐漸建成，一些酶活性也顯示出來，在暴露條件下酶活性的改變也可作為檢測終點；受試物既可抑制酶活性，也可使一些酶出現(xiàn)應激性增強。第35頁/共49頁Grassshrimp(Palaemonetespugio)第36頁/共49頁受試物及其代謝物還可能對遺傳物質產生影響第37頁/共49頁Grassshrimp(Palaemonetespugio)第38頁/共49頁生長指標Catfish(Clariasgariepinus)Pacficherring(Clupeapallasi)第39頁/共49頁應用現(xiàn)狀單一化學品毒性環(huán)境檢測項目檢測土壤、沉積物污染。石油降解產物；溢油事件的生態(tài)恢復研究。混合性工業(yè)生產廢水，生活污水的毒性，特別是致畸效應，被用于探討遺傳毒性。第40頁/共49頁第41頁/共49頁第42頁/共49頁發(fā)展前景盡管胚胎試驗有著高重復性的優(yōu)點，但試驗材料和檢測指標的選取都會影響到試驗的結果。不同發(fā)育階段的材料應選取適當?shù)闹笜?，因不同發(fā)育階段的胚胎對同一毒物具有不同的敏感度。各國研究者正在進一步建立和完善針對更多的試驗材料的胚胎試驗，以滿足各種生態(tài)環(huán)境的評估。隨著多學科專業(yè)相互滲透的加深，工具日益完善，