天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)

第一節(jié)核酸概述1．染色體和基因2．核酸天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第1頁第一節(jié)核酸概述（染色體和基因1）在生物細(xì)胞核中存在著一個能被堿性染料著色螺旋集縮體，它是由核酸、組蛋白、非組蛋白等組成，稱此物質(zhì)為染色體。經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，染色體和基因（遺傳因子）間有平行現(xiàn)象，基因存在于染色體上，基因在遺傳中含有完整性，隨染色體分裂、配對而進(jìn)行獨(dú)立分配。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第2頁第一節(jié)核酸概述（染色體和基因2）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第3頁第一節(jié)核酸概述（染色體和基因3）復(fù)制分開天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第4頁第一節(jié)核酸概述（1核酸發(fā)覺）1868年，從外科繃帶上膿細(xì)胞細(xì)胞核中分離得到一個含磷較高酸性物質(zhì)，稱之為核素。（nuclein）核素實(shí)質(zhì)是一個核糖核蛋白。瑞士科學(xué)家F.Miescher天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第5頁1889年，Altmann首先制備了不含蛋白核酸制品，并引入“核酸”這一名詞。20世紀(jì)20年代測定了核酸化學(xué)組成，并將核酸分為DNA和RNA。1943年，E.Chargaff工作：嘌呤：嘧啶=1：1，由此推理出堿基配正確理論。1944年，Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，證實(shí)遺傳物質(zhì)即為DNA。1953年，Watson-Crick建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。遺傳密碼說明、核酸內(nèi)切酶發(fā)覺、核酸合成與分析技術(shù)、基因重組技術(shù)等建立形成了分子生物學(xué)基本完整體系。第一節(jié)核酸概述（2核酸研究史）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第6頁第一節(jié)核酸概述（核酸種類）核糖核酸（ribonucleicacid-RNA）

轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA-tRNA)

信使RNA(messengerRNA-mRNA)

核糖體RNA（ribosomalRNA-rRNA）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid-DNA）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第7頁第一節(jié)核酸概述（核酸分布）真核生物原核生物

DNA細(xì)胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核）

RNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）細(xì)胞質(zhì)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第8頁第一節(jié)核酸概述（核酸功效）DNA功效：遺傳信息載體，負(fù)責(zé)遺傳信息貯存和公布。RNA功效：三者共同參加遺傳信息表示。

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第9頁第一節(jié)核酸概述（核酸組成）核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解核蛋白蛋白質(zhì)這么看核酸是一個高聚核苷酸，它基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第10頁第二節(jié)核苷酸(總）1．核糖2．堿基3．核苷4．核苷酸5．多磷核苷酸（ATP）核苷核酸核苷酸堿基許多個戊糖磷酸天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第11頁第二節(jié)核苷酸(1戊糖）組成核酸戊糖有兩種

組成DNA

組成RNA天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第12頁第二節(jié)核苷酸(2堿基1）核酸中堿基分兩類：（1）嘧啶堿：胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤堿：腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第13頁尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶CDNA特有RNA特有嘧啶環(huán)第二節(jié)核苷酸(2堿基2[嘧啶1]）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第14頁第二節(jié)核苷酸(2堿基2[嘧啶2]）NNHNH2O胞嘧啶Cytosine(C)NHNHOO尿嘧啶Uracil(U)NHNHOO胸腺嘧啶Thymine(T)注意與書上圖畫法區(qū)分天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第15頁第二節(jié)核苷酸(2堿基3[嘌呤1]）鳥嘌呤G腺嘌呤A嘌呤環(huán)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第16頁第二節(jié)核苷酸(2堿基3[嘌呤2]）NNNHNNH2腺嘌呤Adenine(A)NHNNHNONH2鳥嘌呤Guanine(G)注意與書上圖畫法區(qū)分天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第17頁第二節(jié)核苷酸(3核苷1）核苷是一個糖苷，由戌糖和堿基縮合而成糖與堿基之間以糖苷鍵相連接。糖第一位上碳原子（C1）與嘧啶堿第一位上氮原子（N1）或嘌呤堿第九位上氮原子（N9）相連，所以糖與堿基間連鍵是N-C鍵，普通稱之為N-糖苷鍵。蛋白質(zhì)與糖連接時，天冬酰氨氨基與半羧醛羥基間形成為N-糖苷鍵天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第18頁第二節(jié)核苷酸(3核苷2）糖與堿基之間以C-N糖苷鍵連接天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第19頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸1）核苷中戌糖羥基被磷酸酯化，就形成核苷酸作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第20頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸2）磷酸堿基戊糖天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第21頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸3）H2O堿基磷酸戊糖糖苷鍵脂鍵天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第22頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸4）M-單(D-二；T－三）；P-磷酸RNA名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷—磷酸（脫氧腺苷酸）。八種核苷酸以下表所表示天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第23頁第二節(jié)核苷酸(5多磷核苷酸1）參加核酸生物合成直接原料不是一磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，如ATP（三磷酸腺苷酸）。ATP上磷酸殘基用α、β、γ來編號。ATP含有兩個高能磷酸酯鍵（～P），其水解時釋放出能量為7.3千卡/克分子（普通磷酸酯鍵為2千卡/克分子）。ATP在細(xì)胞能量代謝中起著及其主要作用。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第24頁第二節(jié)核苷酸(5多磷核苷酸2）(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)～～αβγ天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第25頁第三節(jié)核酸結(jié)構(gòu)一、DNA結(jié)構(gòu)

二、RNA結(jié)構(gòu)

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第26頁一、DNA結(jié)構(gòu)1(總）（一）DNA堿基組成

（二）DNA一級結(jié)構(gòu)

（三）DNA二級結(jié)構(gòu)

（四）DNA三級結(jié)構(gòu)

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第27頁（一）DNA堿基組成堿基組成規(guī)律：1．A=T，G=CA+G=C+T2．沒有組織和器官特異性3．含有種特異性4．年紀(jì)、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境改變不影響DNA堿基組成天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第28頁（二）DNA一級結(jié)構(gòu)1各核苷酸殘基沿多核苷酸鏈排列次序叫核酸一級結(jié)構(gòu)。連接鍵：3，5一磷酸二酯鍵連接起來直線形或環(huán)形分子。DNA沒有側(cè)鏈。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第29頁脫H2O脂鍵相連3`，5`-磷酸二酯鍵首尾3`5`5｀3｀連接鍵天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第30頁（二）DNA一級結(jié)構(gòu)3(線條縮寫)DNA線條縮寫:戊糖5`-磷酸PA核苷酸5`3`首端末端PPPPPPAGCTGCOH3`-OH核苷酸次序又稱堿基次序，是蛋白質(zhì)與核酸結(jié)構(gòu)生物語言。鹼基天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第31頁（二）DNA一級結(jié)構(gòu)4(字母簡寫)DNA字母簡寫:

5`

…

APGPCPTPGPCP…3`或5`

…

AGCTGC…3`天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第32頁（二）DNA二級結(jié)構(gòu)1(總)1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)

2．雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定原因3．DNA雙螺旋不一樣類型天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第33頁（二）DNA二級結(jié)構(gòu)2公認(rèn)為1953年watson和crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第34頁（二）DNA二級結(jié)構(gòu)3此模型建立主要基于兩方面依據(jù)（1）堿基組成A=T，C=G，并證實(shí)A與T之間可生成兩個氫鍵，而C與G之間三個氫鍵。（2）X衍射結(jié)構(gòu)分析：不一樣起源DNA纖維含有相同X光衍射圖譜。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第35頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)1（1）（1）DNA分子是由兩條方向相反平行多核苷酸鏈組成。即p5’-糖3‘-p結(jié)構(gòu)與p3’-糖5‘-p結(jié)構(gòu)相對;兩條鏈糖－磷酸主鏈都是右手螺旋，有一共同螺旋軸。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第36頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)1（2）螺旋表面有一條大溝和一條小溝大溝小溝天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第37頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)2（1）（2）兩條鏈由堿基間氫鍵相連，堿基對與螺旋軸垂直,與糖環(huán)平面垂直;堿基在糖環(huán)內(nèi)側(cè)，磷酸基在糖環(huán)外側(cè)；相鄰堿基對平面間距離是0.34nm，相鄰核苷酸彼此相差360，雙螺旋每轉(zhuǎn)有10對核苷酸，每轉(zhuǎn)高3.4nm。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第38頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)3（3）堿基成對有一定規(guī)律：A-T，C-G或T-A，G-CA與T之間為二個氫鍵，C與G之間為三個氫鍵雙螺旋DNA分子整個長度直徑相同，為2nm天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第39頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)3雙螺旋DNA分子整個長度直徑相同，為2nm天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第40頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型關(guān)鍵點(diǎn)4（4）一個鏈堿基次序確定后，則另一條鏈必有相對應(yīng)堿基次序。堿基互補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)含有極主要意義，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等過程分子基礎(chǔ)都是堿基互補(bǔ)配對。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第41頁2．雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定原因1（1）氫鍵（2）離子鍵及范德華力（3）堿基堆積力天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第42頁2．雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定原因2（1）氫鍵：兩條鏈間堿基相互作用，A與T之間為二條氫鍵，C與G之間為三條氫鍵。氫鍵作用力很弱，但DNA分子中存在大量氫鍵，所以氫鍵為一主要穩(wěn)定原因。（2）離子鍵及范德華力：DNA分子中磷酸基因在生理?xiàng)l件下解離，使DNA成為一個多陰離子，這有利于它與帶正電荷其它陽離子基團(tuán)發(fā)生靜電作用，這么降低雙鏈間靜電排斥，有利于雙螺旋穩(wěn)定。（3）堿基堆積力：當(dāng)前普遍認(rèn)為堆積堿基間疏水作用是穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)更主要原因。大量堿基層層堆積，兩相鄰堿基平面十分貼近，于是使雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個強(qiáng)大疏水區(qū)，與介質(zhì)中小分子隔開，有利于互補(bǔ)堿基之間氫鍵形成。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第43頁3．DNA雙螺旋不一樣類型1B型DNA（B－DNA）:在相對濕度為92%時,所得到DNA鈉鹽纖維。A型DNA（A－DNA）:在相對溫度低于75%時，取得DNA鈉鹽纖維。另外還有Z－DNA等。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第44頁3．DNA雙螺旋不一樣類型2天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第45頁（四）DNA三結(jié)構(gòu)當(dāng)研究一些小病毒、線粒體、葉綠體及一些細(xì)菌中分離出來降解DNA時，發(fā)覺它們雙螺旋二級結(jié)構(gòu)還可深入緊縮成閉鏈環(huán)狀或開鏈環(huán)狀以及麻花狀等，這是DNA形成三級結(jié)構(gòu)。松弛形解鏈環(huán)形負(fù)超螺旋天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第46頁二、RNA分子結(jié)構(gòu)1（一）RNA一級結(jié)構(gòu)（二）RNA堿基組成（三）RNA類型（四）RNA二級結(jié)構(gòu)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第47頁（一）RNA一級結(jié)構(gòu)由幾十個至幾千個AMP，GMP，CMP和UMP四種核苷酸借磷酸二酯鍵相連多核苷酸鏈，其中不含側(cè)鏈。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第48頁（二）RNA堿基組成含腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、和尿嘧啶四種堿基，尚含有各種“稀有堿基”和特殊形式核苷。其中以各種甲基化堿基和“假尿嘧啶核苷”尤為豐富。假尿苷這些不尋常成份可能與tRNA生物學(xué)功效有一定關(guān)系天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第49頁（三）RNA類型（rRNA1）含量：75-80%存在：與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白形式，存在于細(xì)胞質(zhì)核蛋白體中。功效：以核蛋白體形式在蛋白質(zhì)生物合成中提供適當(dāng)工作場所。分子量:它分子量都比較大，大腸桿菌核糖體中有三類rRNA（它們沉降系數(shù)分別為5S、16S、23S）；動物細(xì)胞核糖體rRNA有四類（5S、5.8S、18S和28S）。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第50頁（三）RNA類型（rRNA2）大腸桿菌5SRNA結(jié)構(gòu)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第51頁（三）RNA類型（tRNA）含量：約占10－15%存在：tRNA溶于“胞液”部分中，它們以自由狀態(tài)或以氨基酸結(jié)合狀態(tài)而存在。分子量：都較小。功效：蛋白質(zhì)生物合成中起選擇性運(yùn)輸原料（氨基酸）作用，所以把tRNA叫受體RNA。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第52頁（三）RNA類型（mRNA1）含量:占總RNA5%存在：在細(xì)胞核中以DNA為模板被合成以后，可能暫存于核仁內(nèi)，也可能馬上轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，并以每分子mRNA與幾個或幾十個核蛋白體結(jié)合成串珠樣多核蛋白體形式而存在。特點(diǎn)：普通都很不穩(wěn)定，代謝活躍，更新快速，壽命較短，種類很多。功效:在蛋白質(zhì)生物合成中起傳遞遺傳信息作用，故也叫信息RNA（iRNA）。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第53頁（三）RNA類型（mRNA2）真核單順反子5’-末端有“帽子”3’-末端有polyA片段原核多順反子5’-末端無“帽子”3’-末端無polyA片段順反子：mRNA上含有翻譯功效核苷酸次序。polyA片段：指10-200個多聚腺苷酸，這與mRNA順利經(jīng)過核膜進(jìn)入胞漿相關(guān)，也與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到核糖體過程相關(guān)，也有些人認(rèn)為與病毒侵染性相關(guān)。

“帽子”結(jié)構(gòu)：5’-末端G被甲基化，經(jīng)過焦磷酸與另一個發(fā)生了核糖上甲基化核苷酸以5’、5’-磷酸二酯鍵相連,此結(jié)構(gòu)對mRNA翻譯活性是主要。

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第54頁（三）RNA類型（mRNA3）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第55頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)1(總)（1）由四臂四環(huán)組成（2）葉柄是氨基酸臂（3）有反密碼環(huán)（4）左臂連接（D環(huán)）（5）右側(cè)有一個TφC環(huán)（6）含有修飾堿基tRNA三葉草型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（總）D環(huán)反密碼環(huán)TφC環(huán)可變環(huán)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第56頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(1)（1）tRNA普通由四臂四環(huán)組成。分子由A-U、G-C堿基對組成雙螺旋區(qū)叫做臂；不能配對部分叫環(huán)。葉子臂123天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第57頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(2)（2）三葉草葉柄叫做氨基酸臂，它包含3，端接收氨基酸部位—CpCpAOH載運(yùn)氨基酸天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第58頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(3)（3）位于氨基酸臂對面反密碼環(huán)含有組成該tRNA反密碼子三個核苷酸。反密碼子環(huán)

反密碼子天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第59頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(4)（4）左臂連接一個二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)），環(huán)上含有二氫尿嘧啶。D環(huán)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第60頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(5)（5）右側(cè)有一個TΨC環(huán)（含有TΨC次序，φ代表假尿苷）和一個可變環(huán)，不一樣tRNA可變環(huán)上核苷酸數(shù)目改變較大。TΨC天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第61頁（四）RNA二級結(jié)構(gòu)2(5)（6）tRNA分子中含有修飾堿基，但多少不等。在一些位置上核苷酸對于全部tRNA都是一樣，或改變極少叫做不變核苷酸。稀有堿基天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第62頁（五）RNA三級結(jié)構(gòu)1tRNA三級結(jié)構(gòu):倒寫L字母氨基酸接收端3，-端-CCA反密碼子天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第63頁（五）RNA三級結(jié)構(gòu)2tRNA三級結(jié)構(gòu)2天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第64頁第四節(jié)核酸提取、分離和測定一、RNA分離提取二、DNA提取和分離

三、核酸含量測定

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第65頁一、RNA分離提取1當(dāng)前最慣用為酚提取法：即用緩沖液飽和酚溶液直接處理組織或細(xì)胞，以除去其中蛋白質(zhì)和DNA若加入適量十二烷基硫酸鈉或其它去污劑可深入抑制核糖核酸酶，并使蛋白質(zhì)去除得愈加潔凈。將得到RNA提取液用乙醇重復(fù)沉淀數(shù)次，溶解后進(jìn)行透析，再冷凍干燥。提取不一樣種類RNA時，也可將各種亞細(xì)胞部分事先分開（因?yàn)椴灰粯臃N類RNA存在于細(xì)胞中不一樣部位），然后分別從核蛋白體中提取rRNA，從多核蛋白體中提取mRNA，從去除這些成份及其它顆粒后細(xì)胞液中提取tRNA。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第66頁一、RNA分離提取21．密度梯度離心法22．柱層析法3．凝膠電泳法天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第67頁一、RNA分離提取3(1)離心管中放30%--5%蔗糖溶液。欲分離RNA溶液放在蔗糖溶液面上。經(jīng)高速離心數(shù)小時后，分子大小不一樣RNA即分散于不一樣密度蔗糖部位中。應(yīng)用啡啶溴紅—氯化銫密度梯度平衡超離心，可分開不一樣構(gòu)象DNA、RNA和蛋白質(zhì)。1．密度梯度離心法15％蔗糖10％蔗糖20％蔗糖30％蔗糖天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第68頁一、RNA分離提取3(2)1．密度梯度離心法2石蠟油蛋白質(zhì)開環(huán)形及線性DNA閉環(huán)形質(zhì)粒DNARNA用垂直轉(zhuǎn)頭65000轉(zhuǎn)6h，，角轉(zhuǎn)頭45000轉(zhuǎn)36h，離心后，蛋白質(zhì)在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉淀較快，開鏈或環(huán)形DNA沉淀較慢。此法分離DNA純度較高，可供DNA重組等試驗(yàn)用。如需更純品，可再進(jìn)行一次氯化銫密度梯度離心。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第69頁一、RNA分離提取42．柱層析法慣用支持體為二乙胺乙基（DEAE）纖維素（離子交換），葡聚糖凝膠等（凝膠過濾）因?yàn)楹怂岷秃塑账崾莾尚噪娊赓|(zhì)，在一定pH值條件下各解離基團(tuán)解離情況不一樣，即有與蛋白質(zhì)相同等電點(diǎn)（南大P147）。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第70頁一、RNA分離提取53．凝膠電泳法不一樣種類RNA分子所帶電荷與其質(zhì)量之比都非?？拷?，故用普通電泳方法不易分開。若以一些凝膠為支持體進(jìn)行電泳，因?yàn)槟z分子篩作用可影響不一樣RNA泳動速度，則可得到很好分離效果。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第71頁二、DNA提取和分離0.14mol法:處理方法結(jié)果濃NaCl溶液（1-2M）提取組織中核蛋白稀釋至0.14mol后DNA核蛋白沉出RNA核蛋白則不沉出濃NaCl溶解DNA核蛋白氯仿或酚除去其中蛋白質(zhì)乙醇沉淀提取溶液中DNA蔗糖密度梯度離心法分開各種DNACSCl或Cs2SO2濃溶液密度梯度離心法分開單股和雙股DNA天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第72頁三、核酸含量測定1紫外吸收：嘌呤堿與嘧啶堿有共軛雙鍵，使堿基核苷、核苷酸和核酸在240－290nm紫外波段有一強(qiáng)烈吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不一樣核苷酸有不一樣吸收特征，所以能夠用紫外分光光度計定量及定性測定。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第73頁三、核酸含量測定2對待測樣品是否純品可用260nm與280nmOD值，從OD260/280比值即可判斷。純DNA比值應(yīng)為1.8，純RNA為2.0，如樣品中含雜蛋白，測量比值顯著下降。通常1OD值相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA或40μg/ml單螺旋DNA（或RNA）或20μg/ml寡核苷酸計算。不純樣品可用瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶后，經(jīng)啡啶溴紅染色可粗略預(yù)計其含量。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第74頁瓊脂糖凝膠電泳圖三、核酸含量測定2天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第75頁第五節(jié)核酸變性、復(fù)性與雜交一、變性二、復(fù)性三、雜交四、核酸序列分析天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第76頁一、變性1定義：指核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，它并不包括共價鍵（磷酸二酯鍵）斷裂。變性原因：熱變性、酸堿變性等。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第77頁一、變性2天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第78頁一、變性3（Tm值1）通常把DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去二分之一時溫度稱該DNA溶點(diǎn)或溶解溫度，用Tm表示，DNATm值普通在70－850C之間。變性相對量溫度0C60801001.01.21.41.60TmTmTm100%Polyd(A-T)Polyd(G-C)DNA天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第79頁一、變性3（Tm值2）Tm值大小與以下原因相關(guān)：

（1）DNA均一性（2）G-C含量（3）介質(zhì)中離子強(qiáng)度天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第80頁一、變性3（Tm值3）影響Tm值大小原因1（1）DNA均一性：普通均一性越高，Tm值變動范圍越小。（2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm與G-C含量成正比關(guān)系。因?yàn)镚-C比A-T更穩(wěn)定（氫鍵）。Tm與所含G-C多少關(guān)系，可用經(jīng)驗(yàn)公式計算不一樣DNATm：

（G＋C）％＝(Tm－69.3)×2.44天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第81頁一、變性3（Tm值4）Tm與所含G-C多少相關(guān)影響Tm值大小原因2天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第82頁一、變性3（Tm值5）（3）介質(zhì)中離子強(qiáng)度：普通離子強(qiáng)度較低，DNATm值也較低，范圍也越窄。溫度0C70801001.21.41.5901.11.3A2600.010.020.050.20.10.51.0影響Tm值大小原因3大腸桿菌DNA在不一樣KCl濃度下Tm天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第83頁二、復(fù)性1定義：變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分開鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。高溫變性遲緩冷卻熱復(fù)性天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第84頁二、復(fù)性2DNA復(fù)性后，許多物化性質(zhì)又得到恢復(fù)，生物活性能夠得到部分恢復(fù)。但將熱變性DNA驟然冷卻，不能復(fù)性，只有遲緩冷卻時才能夠復(fù)性。高溫變性遲緩冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第85頁二、復(fù)性3（影響原因）1．DNA濃度：濃度高時，兩條互補(bǔ)鏈彼此相碰機(jī)會增加，易于復(fù)性。2．溫度：加熱變性DNA，當(dāng)溫度超出Tm后，如快速冷卻到低溫時不能復(fù)性，但當(dāng)溶液維持在Tm以下較高溫度時，則可復(fù)性，普通比Tm低250C左右時最正確。3．DNA片段大小影響：大線狀單鏈，其擴(kuò)散速度受到妨礙，降低了互補(bǔ)鏈碰撞機(jī)會。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第86頁三、核酸雜交1概念：兩種起源不一樣，含有互補(bǔ)堿基序列多核苷酸片段在溶液中冷卻時，能夠再形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雜交作用。DNA和DNA雜交以及DNA和RNA雜交在核酸技術(shù)中占有十分主要地位。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第87頁三、核酸雜交2

（一）核酸研究主要工具酶（二）核酸雜交技術(shù)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第88頁（一）核酸研究主要工具酶1．核糖核酸酶類（RNA酶類）2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶）3．非專一性核酸酶類天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第89頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類1）

（1）牛胰RNA酶（RNaseA或RNaseI）

（2）RNA酶T1（RNaseT1）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第90頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類2）專一作用RNA，而不作用于DNA;其分子量14,000，最適pH7.0-8.2，十分耐熱;含有高度專一性，作用點(diǎn)為嘧啶核苷－3，—磷酸與其它核苷酸之間連鍵，生成3，－嘧啶核苷或以3，－嘧啶核苷酸結(jié)尾寡核苷酸（南大P152）。PPPPPPC(U)BGA(G)BCOHRNaseIRNaseI（1）牛胰RNA酶（RNaseA或RNaseI）：天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第91頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類3）比RNaseI更含有專一性，其作用點(diǎn)為鳥嘌呤核苷－3，-磷酸與其它核苷酸之間連鍵，產(chǎn)物為3，-鳥苷酸或以其結(jié)尾寡核苷酸。其分子量較小，耐酸耐熱。PPPPPPC(U)BGA(G)BCOHRNaseIRNaseIRNaseT1（2）RNA酶T1（RNaseT1）天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第92頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶1）（1）牛胰脫氧核糖核酸酶（DnaseI）（2）牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseII）（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第93頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶2）（1）牛胰脫氧核糖核酸酶（DnaseI）：此酶無堿基專一性，它切斷雙鏈DNA或單鏈DNA成為以5，－磷酸為末端寡核苷酸，平均長度為四個核苷酸，需Mg2+，最適pH7-8。（2）牛脾脫氧核糖核酸酶（DNaseII）：也無堿基專一性，降解DNA成為以3，—磷酸為末端寡聚核苷酸，平均長度為六個核苷酸，最適pH4-5，需0.3mol/LNa+激活。Mg2+能夠抑制此酶活性。天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第94頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-1）是1979年，Arber、Smith和Nathams等人在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)覺一類對DNA含有極高堿基專一性內(nèi)切酶。是DNA次序測定，基因分離和基因體外重組等研究中十分主要工具酶。這類酶主要降解外源未經(jīng)特殊修飾DNA，但不降解本身細(xì)胞DNA。普通識別次序包含4-6個堿基對。（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第95頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-2）大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別次序含有回文結(jié)構(gòu)（反向重復(fù)序列）。（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)2TTAGCACGTGCTAAAATCGTGCACGATT反向重復(fù)3，5，3，5，天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第96頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-3）大多數(shù)酶切割后形成粘末端（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)3GAATTCCTTAAG3，5，3，5，EcoRIGAATTCCTTAAG3，5，3，5，+粘性末端粘性末端天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第97頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-4）少數(shù)酶切割后形成平整末端（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)3GTPyPuACCAPuPyTG3，5，3，5，HindII平整末端GTPyPuACCAPuPyTG3，5，3，5，+天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第98頁3．非專一性核酸酶類1（1）蛇毒磷酸二酯酶（2）牛脾磷酸二酯酶天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第99頁3．非專一性核酸酶類2（1）對RNA、DNA都有作用，是從核苷酸鏈3，—羥基端開始，逐一切開5，－核苷酸與相鄰核苷酸之間酯鍵，得到5，－核苷酸。（1）蛇毒磷酸二酯酶PPPH2OOHPPPOHOH+天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第100頁3．非專一性核酸酶類2（2）可作用RNA和DNA，是從5，-羥基端開始，逐一切開3，-核苷酸與相鄰核苷酸之間酯鍵，得3，—核苷酸。PPPH2OOH+（2）牛脾磷酸二酯酶PPOHPPPOH天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第101頁（二）核酸雜交技術(shù)1意義：核酸雜交能夠在液相或固相上進(jìn)行，是基因工程和分子生物學(xué)主要技術(shù)之一。是