AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹

試驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第1頁Columnpacking好柱效是層析成功關(guān)鍵不一樣種類凝膠、不一樣層析柱有不一樣裝柱方法柱效測定方法層析柱維護AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第2頁ColumnpackingRabiesvaccineSepharose4FastFlow5%columnvolsampleAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第3頁Columnpacking

mlmAU*ml(volume)%mAU

NoRetAreaArea/PeakareaHeight136.2727.839484.458.2182118.245.126715.550.649每米塔板數(shù)：N=1600

mlmAU*ml(volume)%mAU

NoRetAreaArea/PeakareaHeight136.1450.632598.4816.9742118.540.77911.520.131每米塔板數(shù)：N=3500AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第4頁ColumnpackingN/m=5.54(Ve/Vh)2100/LAs=b/a

AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第5頁Columnpacking檢測裝柱效果普通用<0.5%(30um介質(zhì))或<1%(90um介質(zhì))柱體積1%丙酮測柱效和峰形Thelinearflowrateshouldbe30cm/hfor34μmand50μmmediaand20cm/hfor90μmmediaAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第6頁線性流速對體積不一樣柱子來說，體積流速不能直接用作比較，普通都換算成線性流速，再作比較： 體積流速(ml/min)x60

線性流速(cm/hr)=揪揪揪揪揪揪

柱子橫切面積(cm2)Columnpacking2023/4/24AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第7頁ColumnpackingItisimportantthatthecolumnisproperlyequilibratedbeforethepackingisevaluated(~2columnvolumes).Itispreferabletorunthreetestrunstoseewhetherthetestvaluesarestable.Ifapoorresultimprovesduringthistest,thereasoncanbethatthecolumnwasnotproperlyequilibrated.Tocheckthatthebedisstable,runthecolumnat70%packingpressurefor20hoursandtestitagain(preferablythreetestruns).Notethatpressurespikesmaycausepoorpacking(cracking).Ifthishappens,anairtrapandapressurereliefvalveareneededbetweenthepumpandthecolumn.Thepressurereliefvalveshouldbeplacedbetweentheairtrapandcolumn.AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第8頁ColumnpackingAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第9頁裝柱注意點選擇一根設(shè)計良好柱子仔細混合均勻凝膠漿在生產(chǎn)時使用柱子溫度下裝柱用平緩動作將凝膠漿一次性加入柱子中用恒壓或恒流裝柱穩(wěn)定和平衡凝膠柱床檢驗柱效，必要時重裝ColumnpackingAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第10頁用空柱子須留心.使用調(diào)整器(flowadaptor)-保護柱床同時更可提升分辨率，節(jié)約凝膠柱子物料須生物兼容，并有優(yōu)良化學(xué)抗性加上裝柱器(packingreservoir)，可一次把凝膠裝滿柱子，大大提升柱效，尤其是凝膠過濾柱。柱子過濾網(wǎng)孔徑應(yīng)該是凝膠顆粒1/3,普通10mm孔徑就夠用，如用SOURCE15介質(zhì)裝C柱和XK柱，須換上5mm網(wǎng)2023/4/24AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第11頁Columnpacking

SepharoseFFbasedgel:SepharoseQ,DEAE,SP,Phenyl

1.the75%slurryjustbeforepacking.2.Ideally,FastFlowmediaarepackedataconstantpressurenotexceeding3bar(0.3MPa)forXKcolumns.3.Ifthepackingequipmentdoesnotincludeapressuregauge,useapackingflowrateofatleast400cm/h(15cmbedheight,25℃).Ifrecommendedpressureorflowratecannotbeobrained,usethemaximumflowthepumpcandeliver,thisshouldalsogiveaeasonablywell-packedgel.Donotexceed75%ofthepackingflowrateinsubsequentchromatographicprocedures.

AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第12頁ColumnpackingSepharose4FastFlow50-75%slurryjustbeforepacking.110cm/hflowrateandthepressureshouldnotbeincreasedbeyond1.0bar3-5mmblowthesettledbedwasmadeAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第13頁ColumnpackingSepharcylSHRFlowratesgivenbelow.PackthegelinSTEP1for2hoursoruntilthegelhasreachedaconstantheight,thenincreasetheflowratetothevaluelistedforSTEP2andpackfor60minutes.Packingflowrates(ml/h):ColumnSTEP1STEP2XK16/7060110XK16/10060100XK26/70150300XK26/100150270XK50/100500800AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第14頁ColumnpackingSuperdex75,200pg50%slurry1step:20cm/hflowrate,2hour2step:stepthepressureisheldat3bar,1hourAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第15頁ColumnpackingSephadexG-2550%slurry400cm/hflowrate3mmblowthesettledbedwasmadeAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第16頁層析柱使用及維護柱平衡：在裝柱及做完一個層析后，用最少5倍柱體積緩沖液平衡或柱流出液電導(dǎo)和pH穩(wěn)定。柱再生：用高離子強度緩沖液（1MNaCl)洗脫或改變pH。AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第17頁在位清洗（CIP）離子性吸附蛋白:Washwith0.5CV2MNaCl.Contacttime15min.沉淀、疏水性結(jié)合蛋白及脂蛋白：1MNaClat40cm/h,1-2hours.脂類及非常強結(jié)合疏水性蛋白：2-4CV0.5%非離子去垢劑（或1%醋酸）1-2小時。使用梯度方式70%乙醇或30%異丙醇，2-4CV1-2小時。AKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)介紹第18頁柱子保留0.15mol/LNaAcpH4.020%ethanol0.01mol/LNaOH0.05%sodiumazideAKTA實驗室層析柱裝柱技術(shù)