蛋白質(zhì)組學(xué)修

蛋白質(zhì)組學(xué)修第1頁(yè)/共96頁(yè)基因與其編碼產(chǎn)物蛋白的非線性關(guān)系

遺傳信息從DNA－mRNA－結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)，構(gòu)成一種有機(jī)體，完成生命的功能。

基因→mRNA→蛋白質(zhì)，三位一體，構(gòu)成了遺傳信息的流程圖，這即是傳統(tǒng)的中心法則。

牛牛文庫(kù)文檔分享第2頁(yè)/共96頁(yè)基因組計(jì)劃的局限無(wú)法解決“基因精細(xì)調(diào)控”問(wèn)題大規(guī)模基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)如：微陣列法、DNA芯片及SAGE等，主要從mRNA水平來(lái)考慮。

而“mRNA”水平只反映了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷。實(shí)際上無(wú)法反映蛋白質(zhì)的質(zhì)與量。

牛牛文庫(kù)文檔分享第3頁(yè)/共96頁(yè)P(yáng)roteinproductionpathwayHumangenomicsequencesmRNAProteinproductFunctionalproteinproductionTranscriptioalcontrolTranslationalcontrolPost-translationalcontrolmRNAtellsuswhatmighthappenProteometellsuswhatishappen

牛牛文庫(kù)文檔分享第4頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

基因組(genome)

轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)

一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的mRNA.

蛋白質(zhì)組(proteome)

一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組.

牛牛文庫(kù)文檔分享第5頁(yè)/共96頁(yè)后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)成為研究重心蛋白質(zhì)組學(xué)是其“中流砥柱”，成為戰(zhàn)略制高點(diǎn)從基因組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué)

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SequencedatabasesGenomeWhatcouldhappenGeneExpressiondatabasesTranscriptome+WhatwouldhappenProteinExpressiondatabasesProteome+WhatishappeningRelationalQueryTools

牛牛文庫(kù)文檔分享第7頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26人類基因組計(jì)劃（HGP）：90年代，隨著全球性基因組計(jì)劃尤其是人類基因組計(jì)劃（HGP）規(guī)模空前、速度驚人的推進(jìn)，基因研究已接近“登峰造極”，人類對(duì)生命的理性認(rèn)識(shí)達(dá)到了前所未有的深度和廣度。

牛牛文庫(kù)文檔分享第8頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26蛋白質(zhì)組計(jì)劃：基因組功能的闡明已經(jīng)擺在面前，生命科學(xué)幾乎在轉(zhuǎn)瞬之間開(kāi)始了新的征程——蛋白質(zhì)組計(jì)劃，進(jìn)入了一個(gè)新的紀(jì)元——后基因組時(shí)代。國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織

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以往人類對(duì)于蛋白質(zhì)的研究只是針對(duì)生命活動(dòng)中某一種或某幾種蛋白質(zhì)，難以形成一種整體觀，難以系統(tǒng)透徹地闡釋生命活動(dòng)的基本機(jī)制?；蚴沁z傳信息的源頭功能性蛋白是基因功能的執(zhí)行體大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢(shì)在必行

牛牛文庫(kù)文檔分享第10頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及其意義

蛋白質(zhì)組(proteome)

：一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)：指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究所得到的結(jié)果，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)鑒定、翻譯修飾、蛋白質(zhì)功能確定、蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系、蛋白質(zhì)相互作用。

牛牛文庫(kù)文檔分享第11頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)概念：不僅在同一機(jī)體的不同組織和不同細(xì)胞中不同，而且在同一機(jī)體的不同發(fā)育階段、不同生理或環(huán)境下表現(xiàn)不同。

牛牛文庫(kù)文檔分享第12頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/262

意義每一種生命運(yùn)動(dòng)形式，都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間出現(xiàn)，并發(fā)揮功能的不同組合的結(jié)果?；?/p>

DNA的序列并不能提供這些信息，所以僅用核酸的語(yǔ)言不足以描述整個(gè)生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)組學(xué)是連接基因、蛋白質(zhì)和疾病的紐帶，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化或差異的分析將具有重要的生物學(xué)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值，為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第13頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26由于基因剪接，蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)剪接，基因遺傳信息的表現(xiàn)規(guī)律就更加復(fù)雜，不再是經(jīng)典的一個(gè)基因一個(gè)蛋白的對(duì)應(yīng)關(guān)系。一個(gè)基因可以表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)目可能很大。對(duì)細(xì)菌，可能為1.2～1.3；對(duì)酵母則為3；而對(duì)人，這個(gè)因子可高達(dá)10。

牛牛文庫(kù)文檔分享第14頁(yè)/共96頁(yè)OneGenome–ManyProteomes

牛牛文庫(kù)文檔分享第15頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

2.1蛋白質(zhì)鑒定：

可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。

第二節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容

牛牛文庫(kù)文檔分享第16頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

2.2蛋白質(zhì)功能確定：

可以利用基因敲除和反義技術(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)出來(lái)后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個(gè)很好的工具。

牛牛文庫(kù)文檔分享第17頁(yè)/共96頁(yè)2.3蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用

對(duì)于闡明細(xì)胞乃至整個(gè)生命活動(dòng)的分子機(jī)制具有舉足輕重的意義。細(xì)胞的任何活動(dòng)都需要蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，這也是調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)適度的必要條件。如分析酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析。

牛牛文庫(kù)文檔分享第18頁(yè)/共96頁(yè)2.4蛋白質(zhì)的豐度變化

即各種蛋白質(zhì)的識(shí)別和定量化，是對(duì)不同狀態(tài)細(xì)胞的蛋白質(zhì)差異表達(dá)進(jìn)行比較，一般是指某種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的相對(duì)含量的變化。AB

牛牛文庫(kù)文檔分享第19頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

2.5翻譯后修飾很多mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，因此對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對(duì)闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。

目前主要研究較多的為蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化。

牛牛文庫(kù)文檔分享第20頁(yè)/共96頁(yè)2.6蛋白質(zhì)分布

不同發(fā)育、生長(zhǎng)期和不同生理、病理?xiàng)l件下不同的細(xì)胞類型的基因表達(dá)是不一致的，因此對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的研究應(yīng)該精確到細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平。

牛牛文庫(kù)文檔分享第21頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

2.7藥物的靶分子的確定：

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機(jī)理研究中，這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進(jìn)一步為設(shè)計(jì)作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第22頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)的難點(diǎn)蛋白質(zhì)組的多樣性蛋白質(zhì)的種類確定蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)性蛋白質(zhì)組的時(shí)空性蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)

牛牛文庫(kù)文檔分享第23頁(yè)/共96頁(yè)

第三節(jié)蛋白質(zhì)組研究方法蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)

雙向電泳技術(shù)（2DE）計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)(MS)

牛牛文庫(kù)文檔分享第24頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

蛋白質(zhì)組研究方法雙向電泳技術(shù)：固定化pH梯度膠的出現(xiàn)，改善了雙向電泳的重復(fù)性及上樣量。質(zhì)譜技術(shù)：電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)明及發(fā)展。生物信息學(xué)的創(chuàng)立及其迅速發(fā)展：計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)

牛牛文庫(kù)文檔分享第25頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

3.1蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)雙向電泳技術(shù)（two-dimensionelectrophoresis,2DE）

牛牛文庫(kù)文檔分享第26頁(yè)/共96頁(yè)

雙向電泳原理在雙向電泳中，第一向通常根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同進(jìn)行等電聚焦電泳（IEF），然后再根據(jù)分子量的不同進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）作為第二向。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。

牛牛文庫(kù)文檔分享第27頁(yè)/共96頁(yè)常用雙向電泳設(shè)備第一向等電聚焦電泳系統(tǒng)

第二向中等通量垂直電泳系統(tǒng)

牛牛文庫(kù)文檔分享第28頁(yè)/共96頁(yè)

樣品制備（Samplepreparation）固相預(yù)制膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）膠條的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS電泳（SDS）凝膠的染色及檢測(cè)（Detection/Staining）PDQuest等軟件分析（Softwareanalysis）

雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

牛牛文庫(kù)文檔分享第29頁(yè)/共96頁(yè)等電聚焦電泳

（isoelectricfocusing,IEF）

根據(jù)不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，將蛋白質(zhì)加到含有不同pH值的兩性電解質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠中，蛋白質(zhì)樣品在此凝膠中移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相同的pH梯度處后凈電荷為零，在凝膠中不再移動(dòng)，也就是相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)聚焦在相同pH梯度處，從而把不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分開(kāi)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第30頁(yè)/共96頁(yè)+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH102-D

ElectrophoresisThe1stD:IsoelectricFocusing(IEF)

牛牛文庫(kù)文檔分享第31頁(yè)/共96頁(yè)IEFTheory10or20FractionsAmpholytesgeneratepHgradient(pH3-10)7.59.57.5pI4.57.57.57.5pI4.59.59.59.59.5pI4.5345678910Anode(+)Cathode(-)ACIDBASEProteinsMigratetotheirpI(0netcharge)

牛牛文庫(kù)文檔分享第32頁(yè)/共96頁(yè)IEFTheory10or20FractionsHarvestwithVacuumSource7.59.57.5pI4.57.57.57.5pI4.59.59.59.59.5pI4.5345678910Anode(+)Cathode(-)ACIDBASE

牛牛文庫(kù)文檔分享第33頁(yè)/共96頁(yè)TheRotoforSystemA)InjectsampleB)ApplycurrentC)FocusproteinsD)Harvestfractions

牛牛文庫(kù)文檔分享第34頁(yè)/共96頁(yè)雙向電泳第二向(SDS)

牛牛文庫(kù)文檔分享第35頁(yè)/共96頁(yè)+–pH3pH7.5pH10–pH3pH7.5pH10chargesizeThe2ndD:SDSProteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.Smallestproteinstravelthefurthestdistance

牛牛文庫(kù)文檔分享第36頁(yè)/共96頁(yè)一、樣品制備

牛牛文庫(kù)文檔分享第37頁(yè)/共96頁(yè)樣品制備基本原則使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。

牛牛文庫(kù)文檔分享第38頁(yè)/共96頁(yè)樣品制備（一）細(xì)胞樣品：反復(fù)凍融、超聲破碎組織樣品：碾磨、勻漿植物樣品：碾磨分泌蛋白蛋白質(zhì)樣品的濃縮、去除濾液中的高豐度蛋白菌體蛋白裂解液處理、超聲破碎

牛牛文庫(kù)文檔分享第39頁(yè)/共96頁(yè)雙向電泳樣品的溶解是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一溶解的目標(biāo)：樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液；必須將可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第40頁(yè)/共96頁(yè)增加樣品溶解性的手段離液劑：通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。去垢劑：經(jīng)過(guò)離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去垢劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS應(yīng)用最普遍。還原劑：在離液劑和去垢劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。

牛牛文庫(kù)文檔分享第41頁(yè)/共96頁(yè)兩性載體電解質(zhì)：即便在離液劑和去垢劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀兩性載體電解質(zhì)的作用在于補(bǔ)充樣品中少量的鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過(guò)高會(huì)使IEF的升壓困難、速度降低。

牛牛文庫(kù)文檔分享第42頁(yè)/共96頁(yè)樣品中核酸的去除對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過(guò)超速離心來(lái)去除復(fù)合物。ReadyPrep2-Dcleanupkit

牛牛文庫(kù)文檔分享第43頁(yè)/共96頁(yè)

二、適用于質(zhì)譜的染色方法考馬斯亮蘭（Coomassie

stain）

銀染（SilverStain）熒光染色（SYPRORubyproteingelstain）

牛牛文庫(kù)文檔分享第44頁(yè)/共96頁(yè)考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)范圍30-100ng，靈敏度較低，但染色過(guò)程簡(jiǎn)單，所需試劑少，操作簡(jiǎn)便，無(wú)毒性，染色后背景及對(duì)比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。膠體考馬斯亮藍(lán)染色的檢測(cè)靈敏度為8-10ng，但染色時(shí)間較長(zhǎng)（24-48小時(shí)），染色過(guò)程給下游質(zhì)譜檢測(cè)帶來(lái)較多不便。Bio-Safe染料是一種改良的膠體金染色方法。安全無(wú)污染，染色非常快（2小時(shí)），完全與下游質(zhì)譜兼容。

牛牛文庫(kù)文檔分享第45頁(yè)/共96頁(yè)銀染銀染的檢測(cè)靈敏度很高，可達(dá)到200pg，但其線性很差。普通的銀染過(guò)程中因醛類的特異反應(yīng)，而與下游質(zhì)譜不兼容?？焖巽y染法，可與下游質(zhì)譜兼容，但其檢測(cè)靈敏度較低，并伴有很深的背景干擾。

牛牛文庫(kù)文檔分享第46頁(yè)/共96頁(yè)熒光染料SYPRORuby染料靈敏度2-10ng，靈敏度與銀染相仿，不對(duì)核酸染色染色所需時(shí)間較短染色的動(dòng)態(tài)線性范圍大大優(yōu)于膠體金染色，擴(kuò)展了約1000倍。熒光試劑顯色對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)固定作用，不干擾質(zhì)譜或免疫檢測(cè)過(guò)程Cy3和Cy5兩種染料可分別對(duì)兩種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，在一塊2-D膠上同步運(yùn)行，可以很方便的找出差異但因其需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾、改變了標(biāo)記蛋白質(zhì)的移動(dòng)性能由于熒光探針猝滅作用會(huì)引起快速衰減。蛋白與蛋白之間由于可被熒光團(tuán)修飾的功能基團(tuán)數(shù)目不同而使得靈敏度變化很大熒光團(tuán)的加入會(huì)降低蛋白質(zhì)溶解性能。

牛牛文庫(kù)文檔分享第47頁(yè)/共96頁(yè)負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。

牛牛文庫(kù)文檔分享第48頁(yè)/共96頁(yè)pIM.Wt.100gofE.coliprotein

牛牛文庫(kù)文檔分享第49頁(yè)/共96頁(yè)綜合的數(shù)據(jù)管理PDQuestImageDifferentialAnalysisSpotCuttingProteinDigestionMassSpecPMF/MS-MSGlobalDatabaseSearch/ProteinIDPDQuestImageAuto-annotation

牛牛文庫(kù)文檔分享第50頁(yè)/共96頁(yè)激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割（lasercapturemicrodissection,LCM）技術(shù)可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細(xì)胞類型，因此LCM技術(shù)實(shí)際上是一種原位技術(shù)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第51頁(yè)/共96頁(yè)IsolationofSubcellularFractionsIsolationofmouselivernuclearproteinsCytoplasmicproteinsNucleiproteinspH3-10NL,17cmReadyStripIPGstrips,8–16%gel

牛牛文庫(kù)文檔分享第52頁(yè)/共96頁(yè)激光捕獲顯微切割儀

牛牛文庫(kù)文檔分享第53頁(yè)/共96頁(yè)LCM優(yōu)點(diǎn)與不足優(yōu)點(diǎn)(1)快速簡(jiǎn)單、高效直觀、減少交叉污染；(2)制樣靈活，使用范圍廣；(3)不但能有效保持分離樣品結(jié)構(gòu)的完整，而且不會(huì)破壞周圍臨近組織的完整。

牛牛文庫(kù)文檔分享第54頁(yè)/共96頁(yè)不足(1)用于顯微切割的組織切片必須脫水干燥；(2)盡管LCM可以獲得用于不同分子分析技術(shù)所需的幾乎純凈的細(xì)胞，但捕獲大量組織仍需要大量時(shí)間。(3)組織標(biāo)本缺乏蓋玻片與屈光介質(zhì)，使得顯微鏡觀察到的組織現(xiàn)象模糊。

牛牛文庫(kù)文檔分享第55頁(yè)/共96頁(yè)3.2蛋白質(zhì)分析與鑒定技術(shù)Edman降解法測(cè)N端序列

Edman降解法測(cè)序速度慢、費(fèi)用偏高、靈敏度也不如快速發(fā)展的質(zhì)譜,但它測(cè)定的肽序列非常準(zhǔn)確，成為蛋白質(zhì)鑒定的可靠依據(jù)。通過(guò)C-末端和N-末端鑒定蛋白質(zhì)是一種非常有效的手段，蛋白質(zhì)中N-末端四個(gè)氨基酸特異性在43％和83％之間，而C-末端四個(gè)氨基酸特異性在74%和97%之間，更長(zhǎng)的氨基酸則特異性更高。3.2.1蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)

牛牛文庫(kù)文檔分享第56頁(yè)/共96頁(yè)

牛牛文庫(kù)文檔分享第57頁(yè)/共96頁(yè)3.2.2圖譜分析技術(shù)（Imageanalysis）

圖譜分析作為雙向電泳的重要一步，其作用是評(píng)價(jià)和量化電泳結(jié)果。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，需要用圖像分析軟件進(jìn)行正常和異常，或發(fā)育不同階段細(xì)胞、組織等電泳圖譜間的匹配。

牛牛文庫(kù)文檔分享第58頁(yè)/共96頁(yè)圖譜處理分析典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：

牛牛文庫(kù)文檔分享第59頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖

牛牛文庫(kù)文檔分享第60頁(yè)/共96頁(yè)3.2.2生物質(zhì)譜技術(shù)生物質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異化來(lái)分離并確定分子質(zhì)量。它具有高通量、靈敏、準(zhǔn)確、自動(dòng)化等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的Edman降解測(cè)序和氨基酸組成分析，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于二維電泳、色譜分離的蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的鑒定。

牛牛文庫(kù)文檔分享第61頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(ｍ/ｚ)在真空系中飛行速度的差異來(lái)分離并確定其分子量。生物質(zhì)譜儀通常包含三個(gè)部分：離子源，質(zhì)量分析器和檢測(cè)器。MALDI常用于分析蛋白質(zhì)的酶切提取肽段混合物，進(jìn)而獲得肽質(zhì)量指紋譜(PMF)，用MALDI－TOF儀器可以獲得質(zhì)量和精確度均佳的結(jié)果。（1）基質(zhì)輔助激光解吸附離子化質(zhì)譜（Matrix-assisted-laser-desorption-time-of-flight,MALDI-TOF/MS）

牛牛文庫(kù)文檔分享第62頁(yè)/共96頁(yè)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀

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牛牛文庫(kù)文檔分享第64頁(yè)/共96頁(yè)（2）電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜

電噴霧電離（ESI）利用位于一根毛細(xì)管和質(zhì)譜儀進(jìn)口間的電勢(shì)差生成離子，電噴霧電離的特點(diǎn)是可生成高度帶電的離子而不發(fā)生碎裂，這樣可將質(zhì)荷比（m/z）降低到各種不同類型的質(zhì)量分析儀都能檢測(cè)的范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量可根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。電噴霧電離（ESI）原理

牛牛文庫(kù)文檔分享第65頁(yè)/共96頁(yè)ESI過(guò)程圖解帶正電的離子溶劑從液滴上蒸發(fā)最初的液滴+++++++++++++++++++質(zhì)量分析器真空大氣約3～5kV

牛牛文庫(kù)文檔分享第66頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

將肽段注入質(zhì)譜儀中，蛋白質(zhì)沿氨基端被打碎為幾個(gè)片段。這幾個(gè)片段在第一個(gè)質(zhì)譜中得到分離，然后，這些片段的質(zhì)量在第二個(gè)質(zhì)譜中得到測(cè)定。串聯(lián)質(zhì)譜（tandamMS）

牛牛文庫(kù)文檔分享第67頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

所有獲得的片段質(zhì)量信息經(jīng)過(guò)處理就形成該肽段的MS∕MS譜圖，所獲得的肽序列標(biāo)簽再在表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)中查找以鑒定該蛋白。有些商品化儀器把反向液相色譜與MS相偶聯(lián)，自動(dòng)化LC－MS∕MS，CE－MS∕MS儀器可以產(chǎn)生幾百至幾千個(gè)MS∕MS譜圖，這樣就有可能分析那些高度復(fù)雜復(fù)合物。

牛牛文庫(kù)文檔分享第68頁(yè)/共96頁(yè)（3）與質(zhì)譜（massspectrometry）相關(guān)的技術(shù)肽質(zhì)量指紋圖譜法（peptidemassfingerprint，PMF）肽片段（peptidefragment）的部分測(cè)序氨基酸組分分析微量測(cè)序

牛牛文庫(kù)文檔分享第69頁(yè)/共96頁(yè)肽質(zhì)量指紋圖譜法（peptidemassfingerprint，PMF）未知蛋白胰酶切質(zhì)量譜圖及標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖譜

牛牛文庫(kù)文檔分享第70頁(yè)/共96頁(yè)氨基酸組分分析系統(tǒng)

牛牛文庫(kù)文檔分享第71頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

大量數(shù)據(jù)庫(kù)將支持基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。目前，主要數(shù)據(jù)庫(kù)有蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如SWISS－PROT）、核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）、二維凝膠數(shù)據(jù)庫(kù)（如SWISS-2DPAGE）、翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫(kù)（如-O-GLYCBASE）、代謝數(shù)據(jù)庫(kù)等。3.3生物信息學(xué)(bioinformatics)

牛牛文庫(kù)文檔分享第72頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

4.1表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)該方法具有能夠確定蛋白質(zhì)量和檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄后修飾的優(yōu)點(diǎn)?？梢垣@得某種條件下的樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，這樣就能夠進(jìn)行比較蛋白質(zhì)分析，從而在分子水平上闡明一些疾病發(fā)病機(jī)理，有利于疾病的診斷及治療。比較雙向電泳表達(dá)圖譜與相應(yīng)的分化基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)的研究表明：mRNA及其相應(yīng)蛋白質(zhì)不一定存在相關(guān)性，如mRNA與其翻譯的蛋白質(zhì)并不是1：1的關(guān)系。第四節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究前景

牛牛文庫(kù)文檔分享第73頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

人類4萬(wàn)個(gè)基因只有不到1000個(gè)主要疾病的藥物靶標(biāo)，找到這些有用的靶標(biāo)是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。通過(guò)與之相關(guān)連的蛋白質(zhì)、細(xì)胞定位和在刺激物誘導(dǎo)下的變化情況來(lái)推斷一種蛋白的功能。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的純化和質(zhì)譜鑒定直接測(cè)定蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用。這一方法已經(jīng)被證實(shí)在發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)分子復(fù)合物的組分過(guò)程中具有很重要的價(jià)值。

4.2

蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用研究

牛牛文庫(kù)文檔分享第74頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)相互作用研究策略和方法1.生化方法蛋白質(zhì)親和層析親和印跡免疫共沉淀化學(xué)交聯(lián)法熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）生物傳感器技術(shù)（BIA）2.分子生物學(xué)方法酵母雙雜法噬菌體展示

牛牛文庫(kù)文檔分享第75頁(yè)/共96頁(yè)2023/4/26

用親和純化、亞細(xì)胞分離及質(zhì)譜鑒定可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，再加以基因標(biāo)簽的系統(tǒng)使用，能夠得到許多蛋白質(zhì)復(fù)合物及其各種蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位的圖譜。對(duì)不同細(xì)胞類型及在不同環(huán)境下的細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，可以畫出一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分布圖譜，通過(guò)對(duì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)分布圖譜的了解，有助于闡明生命活動(dòng)規(guī)律及檢測(cè)藥物靶標(biāo)的有效性，促進(jìn)藥物基因組學(xué)的發(fā)展。4.3

細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)（cell-mappingproteomics）

牛牛文庫(kù)文檔分享第76頁(yè)/共96頁(yè)總之：蛋白質(zhì)組學(xué)主要有兩個(gè)研究策略：“竭澤法”：即采用高能量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)?！肮δ芊ā保杭囱芯坎煌瑫r(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標(biāo)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第77頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展趨勢(shì)隨著整合樣品處理、分級(jí)分離、質(zhì)譜鑒定以及數(shù)據(jù)分析軟件平臺(tái)為一體的蛋白組學(xué)研究系統(tǒng)的不斷推陳出新，以及適于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)平臺(tái)的建立，蛋白組學(xué)己經(jīng)成為生命科學(xué)研究中的重要支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)與其它大規(guī)?？茖W(xué)如基因組學(xué)，生物信息學(xué)等領(lǐng)域的交叉，所呈現(xiàn)出的系統(tǒng)生物學(xué)（systembiology）研究模式，將成為未來(lái)生命科學(xué)最令人激動(dòng)的新前沿。

牛牛文庫(kù)文檔分享第78頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用在應(yīng)用研究方面，蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示出廣泛的應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)組學(xué)研究特別是定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，標(biāo)志著蛋白質(zhì)組學(xué)研究正由定性向準(zhǔn)確的定量方向發(fā)展。它將為人們更加完整地揭示生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝調(diào)控等生命活動(dòng)的規(guī)律和嚴(yán)重疾病的發(fā)生機(jī)理，為人類進(jìn)行疾病的診斷、防治和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第79頁(yè)/共96頁(yè)在原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究方面流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究(Haemophilusinfluenzae)大腸桿菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究致病微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

牛牛文庫(kù)文檔分享第80頁(yè)/共96頁(yè)在多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究方面線蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究果蠅的蛋白質(zhì)組學(xué)研究人類的蛋白質(zhì)組學(xué)研究植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

牛牛文庫(kù)文檔分享第81頁(yè)/共96頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)蛋白質(zhì)組學(xué)已成為重要的前沿領(lǐng)域之一。各個(gè)國(guó)家和地區(qū)都已將蛋白質(zhì)組學(xué)作為優(yōu)先支持發(fā)展的領(lǐng)域，相繼啟動(dòng)各具特色的大型蛋白質(zhì)組學(xué)研究計(jì)劃，大力推動(dòng)本國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，力圖在這場(chǎng)新世紀(jì)最激烈的生命科學(xué)競(jìng)爭(zhēng)中取得先機(jī)，搶占一席之地。

牛牛文庫(kù)文檔分享第82頁(yè)/共96頁(yè)6.2.1蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀國(guó)外研究現(xiàn)狀：美國(guó)NCI－肺、直腸、乳腺和卵巢等腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)NCI與FDA－有關(guān)癌癥不同發(fā)病階段和治療階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)歐共體－酵母蛋白質(zhì)組研究英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、澳大利亞、日本等國(guó)也分別投入巨資進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究此外，Celera公司、日內(nèi)瓦蛋白質(zhì)組公司與布魯克質(zhì)譜儀制造公司

牛牛文庫(kù)文檔分享第83頁(yè)/共96頁(yè)國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀：國(guó)家自然科學(xué)基金委于1997年設(shè)立了重大項(xiàng)目“蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的建立”中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院與湖南師范大學(xué)已啟動(dòng)蛋白質(zhì)組研究中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院與復(fù)旦大學(xué)相繼成立了專門的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心

牛牛文庫(kù)文檔分享第84頁(yè)/共96頁(yè)國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀：

在“重大疾病的功能蛋白質(zhì)組學(xué)”方面取得了良好的起步已進(jìn)行肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞蛋白質(zhì)組的比較分析研究，發(fā)現(xiàn)了兩者間不同的蛋白表達(dá)群進(jìn)行了我國(guó)自行建立的肝癌高/低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系、肺癌高/低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系、原位食管癌/轉(zhuǎn)移食管癌間的比較蛋白質(zhì)組研究，初步發(fā)現(xiàn)一批與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)群對(duì)心肌細(xì)胞與應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組研究也有了一定的基礎(chǔ)

牛牛文庫(kù)文檔分享第85頁(yè)/共96頁(yè)我國(guó)“蛋白質(zhì)組研究計(jì)劃”應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題一是“人類基因組”、“水稻基因