血清成分的生化分析

血清成分的生化分析第1頁/共50頁實(shí)驗(yàn)六血清清蛋白與γ-球蛋白的分離及鑒定生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院生化組第2頁/共50頁總體步驟：鹽析→透析→濃縮→電泳（期間穿插凝膠柱層析）一、鹽析

50%飽和度，血清球蛋白沉淀

α、β、γ-（33%飽和度沉淀）

100%飽和度，血清清蛋白沉淀（NH4）2SO4：破壞水膜、中和電荷純度鑒定：層析（柱）、電泳等第3頁/共50頁二、透析目的：去鹽（柱層析也可）透析袋：裝樣量：1/2～2/3三、濃縮目的：去水（蔗糖）四、電泳目的：鑒定清蛋白和

γ-球蛋白純度五、層析練習(xí)：分離藍(lán)葡聚糖和重鉻酸鉀（藍(lán)色+黃色）第4頁/共50頁實(shí)驗(yàn)材料雞血清：三黃雞血清

或?yàn)豕请u血清第5頁/共50頁實(shí)驗(yàn)六——（一）血清清蛋白與γ-球蛋白的鹽析、透析與濃縮第6頁/共50頁一、目的1、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和方法2、掌握透析法脫鹽及蛋白質(zhì)濃縮的方法第7頁/共50頁二、試劑及儀器用品血清PBS

（NH4）2SO4溶液

蔗糖雙縮脲試劑酪蛋白

BaCl2溶液離心機(jī)燒杯移液管透析袋第8頁/共50頁三、原理中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面的雙電層和水膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。沉淀不同蛋白質(zhì)所需鹽類濃度不同。如，50％飽和的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀。因此，可根據(jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析。第9頁/共50頁

透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能通過半透膜的性質(zhì)的一類純化方法，可利用該方法分離大分子與小分子的混合物。由于NH4+和SO42-可以通過半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脫鹽。第10頁/共50頁透析裝置第11頁/共50頁

利用半透膜還可以進(jìn)行大分子溶液的濃縮。將盛有待濃縮的大分子溶液的透析袋放入高濃度的吸水性強(qiáng)的蔗糖固體顆粒中，袋內(nèi)溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地濃縮。第12頁/共50頁四、實(shí)驗(yàn)步驟1、鹽析、透析與濃縮離心管2mL血清2mLPBS2mL（NH4）2SO4搖勻靜置30′3000rps離心20′上清液（主要含清蛋白）沉淀（主要含γ-球蛋白）第13頁/共50頁3.132g（NH4）2SO4上清液靜置30′，離心20′1mL水（或PBS）沉淀流水透析1h蔗糖濃縮清蛋白1mLPBS沉淀1mL水（或PBS）流水透析1h蔗糖濃縮γ-球蛋白滴加0.5mL（NH4）2SO4靜置30′，離心20′沉淀（γ-球蛋白）第14頁/共50頁實(shí)驗(yàn)六——（二）血清清蛋白與γ-球蛋白的鑒定——醋酸纖維薄膜電泳第15頁/共50頁一、目的學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作了解電泳技術(shù)的一般原理。第16頁/共50頁二、原理

醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，它具有均一的泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120μm微米，有強(qiáng)滲透性，對分子移動(dòng)無阻力，作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡便，快速，樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清蛋白，脂蛋白，血紅蛋白，糖蛋白和同工酶的分離及用在免疫電泳中。第17頁/共50頁

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在pH不等于其等電點(diǎn)的溶液中，可帶有電荷，在電場中會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等蛋白質(zhì)，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對分子質(zhì)量、形狀及等電點(diǎn)不同，在電場中遷移速度就不同，故通過電泳法可將其分離。第18頁/共50頁三、實(shí)驗(yàn)器材1、醋酸纖維薄膜（2×8cm）2、常壓電泳儀、電泳槽3、點(diǎn)樣器（市售或自制）4、培養(yǎng)皿（染色及漂洗用）5、粗濾紙、直尺、單面刀片、電吹風(fēng)6、玻璃板7、竹鑷子8、白磁反應(yīng)板等第19頁/共50頁四、實(shí)驗(yàn)試劑1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（pH8.6，離子強(qiáng)度0.07）：1000mL：巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，加水至1000mL。

2、染色液：300mL

含氨基黑10B0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL〈可重復(fù)使用〉。

3、漂洗液：2000mL

含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL。4、透明液：300mL：含無水乙醇7份，冰醋酸3份。5、血清：新鮮，無溶血現(xiàn)象第20頁/共50頁五、操作總體步驟：膜處理——30′裝置——電泳槽電極緩沖液：兩槽等高搭橋點(diǎn)樣→電泳→染色→漂洗→透明需做三條膜：全血清、γ-球蛋白、清蛋白第21頁/共50頁1、膜處理——膜的浸泡用無齒鑷子取醋酸纖維薄膜一張（識別出光澤面與無光澤面，并在角上做好記號）放在緩沖液中浸泡20min。第22頁/共50頁2、電泳槽的準(zhǔn)備根據(jù)薄膜寬度剪裁合適的濾紙條。在兩個(gè)電極槽中各倒入等體積電極緩沖液，在電泳槽兩個(gè)膜支架上各放兩層濾紙條，濾紙的一端與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部潤濕后，用玻棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)逐氣泡，使該端濾紙緊貼于膜支架上。濾紙條是兩個(gè)電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。第23頁/共50頁3、點(diǎn)樣把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙中吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。將點(diǎn)樣器先于放置在白磁反應(yīng)板上的血清中沾一下，再在膜條一端2～3cm處輕輕地水平地落下并隨即提起，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。+-第24頁/共50頁點(diǎn)樣說明：點(diǎn)樣位點(diǎn)不可直接在薄膜上劃線，以免破壞薄膜。可制備點(diǎn)樣模板：取等大小濾紙條，在距紙邊1.5～2cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點(diǎn)樣標(biāo)志區(qū)。點(diǎn)樣后要在薄膜上形成具一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。此步驟是實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)。點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。第25頁/共50頁4、電泳將膜條上點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極（點(diǎn)樣面朝下，要求膜緊貼濾紙并繃直，中間不能下垂。若電泳槽中同時(shí)安放幾張薄膜，則薄膜間應(yīng)相隔幾mm）。蓋嚴(yán)電泳室，平衡10min。通電。調(diào)節(jié)電壓到160V，電流強(qiáng)度0.4～0.6mA/cm（毫安/厘米）膜寬，電泳時(shí)間約為45～60min。第26頁/共50頁第27頁/共50頁5、染色電泳完畢后，將膜條取下并放在染色液中浸泡5～10min。6、漂洗將膜條從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次到無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得色帶清晰的電泳圖譜。第28頁/共50頁7、定量⑴、將膜條用濾紙壓平吸干，按區(qū)帶分段剪開，分別浸在4.0mL0.4mol/L氫氧化鈉溶液中半小時(shí)，并剪取相同大小的無色帶膜條作空白對照，在A650nm進(jìn)行比色。⑵、將干燥的電泳圖譜膜條放在潔凈的玻璃板上，將透明液滴入，待膜條完全透明后用吹風(fēng)機(jī)吹干或放入烘箱中烘干，可用光密度計(jì)直接測定，此圖譜可長期保存。第29頁/共50頁實(shí)驗(yàn)六——（三）凝膠層析（練習(xí)實(shí)驗(yàn)）第30頁/共50頁一、目的掌握凝膠過濾層析的技術(shù)方法第31頁/共50頁二、凝膠柱層析原理1、凝膠層析也稱凝膠過濾，是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠的層析技術(shù)。2、當(dāng)樣品流經(jīng)這類凝膠的固定相時(shí)，不同分子大小的各組分因進(jìn)入網(wǎng)孔受阻滯的程度不同而以不同的速度通過層析柱，從而達(dá)到分離的目的。第32頁/共50頁3、當(dāng)樣品通過層析柱時(shí)，分子量較大的物質(zhì)因?yàn)椴荒芑蜉^難通過網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，而是沿著凝膠顆粒間的間隙流動(dòng)，所以流程較短，向前移動(dòng)的速度較快，即受阻滯的程度較小，最先流出層析柱；反之，分子量較小的物質(zhì)，因?yàn)轭w粒直徑小，可通過網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程較長，向前移動(dòng)的速度較慢，即受阻滯的程度較大，流出較晚。第33頁/共50頁第34頁/共50頁

本實(shí)驗(yàn)采用SephandexG-25凝膠柱分離重鉻酸鉀和藍(lán)葡聚糖混合物。

Sephandex：葡聚糖凝膠。G20、G30······G200等，編號越小，篩孔越小。根據(jù)需要選取適當(dāng)型號可分離高分子物質(zhì)或脫鹽等。第35頁/共50頁三、試劑及儀器用品（1）SephandexG-25（1）鐵架臺(tái)（2）生理鹽水（2）凝膠柱（3）重鉻酸鉀（3）玻璃棒（4）藍(lán)葡聚糖（4）燒杯（5）試管（6）膠頭吸管第36頁/共50頁四、實(shí)驗(yàn)步驟1、凝膠預(yù)處理稱取8gG-25→

放入250mL燒杯中→

100mL蒸餾水→小火煮沸1h→

靜止、冷卻→傾棄蒸餾水→加入10mLPBS→

輕輕攪拌至凝膠懸起→傾入10cm×1.0cm層析柱。第37頁/共50頁2、裝柱將全部凝膠都傾入柱內(nèi)，當(dāng)液面接近凝膠面時(shí)，用螺旋夾將橡膠管夾緊，然后小心放松螺旋夾，使液體緩慢流出（4～5d/m），到液體剛好流入凝膠面時(shí)，將螺旋夾再夾緊，裝柱工作完成。第38頁/共50頁3、加樣用膠頭吸管將柱中上方清液吸出，加入重鉻酸鉀和藍(lán)葡聚糖混合溶液，用膠塞封住上口。4、洗脫用生理鹽水洗脫液進(jìn)行洗脫。打開螺旋夾，使液體的流速達(dá)到10～15d/m。第39頁/共50頁5、收集混合液在凝膠柱中分離，藍(lán)色的藍(lán)葡聚糖在下方，黃色的重鉻酸鉀在上方。用試管收集流出藍(lán)、黃色液體，比色并畫出洗脫曲線。第40頁/共50頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.洗脫曲線例子實(shí)際洗脫曲線2.實(shí)驗(yàn)結(jié)論

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果第41頁/共50頁第42頁/共50頁第43頁/共50頁第44頁/共50頁可通過凝膠過濾對樣品脫鹽第45頁/共50頁一、實(shí)驗(yàn)原理*鹽析分離所得之γ-球蛋白，在進(jìn)一步純化之前，先要將其中的硫酸銨除去。凝膠過濾法較之透析法是一種快速有效的方法。*當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、硫酸銨混合物流經(jīng)SephadexG-25柱時(shí)，硫酸銨滲入SephadexG-25內(nèi)部，而蛋白質(zhì)被排阻在外，因此，蛋白質(zhì)隨溶劑先流出，硫酸銨后流出。故能將二者分開。第46頁/共50頁二、操作方法1．裝柱

*取層析柱1根（1.5×20cm），垂直于固定架上，夾住流出口；

*加10ml磷酸鹽緩沖液（0.0175mol/L，pH6.7）于柱中；

*將溶脹好的SephadexG－25傾倒去水，加入磷酸鹽緩沖液（0.0175mol/L