血清堿性磷酸酶活性測(cè)定

血清堿性磷酸酶活性測(cè)定第1頁(yè)/共18頁(yè)?實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰富盍y(cè)定的一般方法掌握血清中ALP活力測(cè)定方法掌握血清中ALP測(cè)定的臨床意義第2頁(yè)/共18頁(yè)?思考？如何測(cè)定酶活力的大小？

酶活力：酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度的大小。

酶促反應(yīng)的速度：常用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)表示。

反應(yīng)速度↑活力↑第3頁(yè)/共18頁(yè)酶活力測(cè)定方法終止測(cè)定法（或定時(shí)法）：*本次實(shí)驗(yàn)的方法

通常是酶作用一段時(shí)間后，加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。連續(xù)監(jiān)測(cè)法：連續(xù)監(jiān)測(cè)法是指每隔一定時(shí)間（2～60s），連續(xù)多次測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物量隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法。適用于自動(dòng)生化分析儀目前已取代固定時(shí)間法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)第4頁(yè)/共18頁(yè)什么是ALP？堿性磷酸酶ALP是一組在堿性環(huán)境中水解磷酸酯的酶類(lèi)。來(lái)源：廣泛分布于人體的骨、腎、肝、腸、血清、膽汁等部位，但骨骼、牙齒、腎和肝臟中含量較多。正常人血清中ALP主要來(lái)源于肝臟。是一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，即通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類(lèi)底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團(tuán)的過(guò)程稱(chēng)為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中有最大活力。第5頁(yè)/共18頁(yè)?實(shí)驗(yàn)原理測(cè)定ALP的方法主要分為兩種一是測(cè)定底物解離下的磷酸根來(lái)計(jì)算酶活力，如β-甘油磷酸鈉法，但存在血清本身有磷酸根的缺點(diǎn)；二是測(cè)定底物解離磷酸根后的羥基化合物，這種方法又可分為：酚化合物在顯色劑的作用下顯色比色測(cè)定。生成的酚化合物本身在一定的條件下就可顯色，如對(duì)硝基苯磷酸二鈉（PNPP）法

第6頁(yè)/共18頁(yè)在PH=10的環(huán)境中，ALP催化磷酸苯二鈉水解→苯酚和磷酸氫二鈉苯酚與4-氨基安替比林

→色素原該色素原經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞胺衍生物測(cè)定紅色物質(zhì)的吸光度就可以計(jì)算酶活力的大小。磷酸苯二鈉+H2O(ALP,PH=10)

→苯酚+磷酸氫二鈉苯酚+4-氨基安替比林（鐵氰化鉀）→醌亞胺衍生物第7頁(yè)/共18頁(yè)試劑與儀器（一）

0.1mol/L碳酸鹽緩沖液（含4-氨基安替比林）4-氨基安替比林：

淡黃色結(jié)晶。熔點(diǎn)109℃。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。

4一氨基安替比林用量與吸光度成正相關(guān)，需準(zhǔn)確加入。鐵氰化鉀用量不足時(shí)，反應(yīng)不完全，測(cè)量結(jié)果偏低，因此鐵氰化鉀用量必須加足或稍稍過(guò)量

（二）20mmol/L磷酸苯二鈉溶液（三）鐵氰化鉀的硼酸溶液（四）酚標(biāo)準(zhǔn)工作液器材：

5ml移液管、1ml移液管、加樣槍、分光光度計(jì)、1cm比色皿

37°C水浴鍋第8頁(yè)/共18頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作取4支試管，如下操作：立即混勻。用510nm波長(zhǎng)（紅色醌物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)）比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。*保持反應(yīng)時(shí)溫度是均衡的，37°C第9頁(yè)/共18頁(yè)計(jì)算公式ALP活性金氏單位定義:

每100ml血清再37攝氏度時(shí)與底物作用15分鐘，產(chǎn)生酚1mg為1金氏單位。ALP活性=(At-Ac)/(As-Ab)*0.05*100(金氏單位)參考值成人：3~13金氏單位；兒童：5~28金氏單位。第10頁(yè)/共18頁(yè)注意事項(xiàng)酚標(biāo)準(zhǔn)液開(kāi)后不能久置。底物液不能含有酚，若含酚則顯紅色，說(shuō)明磷酸苯二鈉已分解，不宜使用。加入鐵氰化鉀后必須迅速混勻(為了改變PH來(lái)終止酶促反應(yīng)），否則有影響，偏大。鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定最后所顯色的作用。此液應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍(lán)綠色即作廢。第11頁(yè)/共18頁(yè)臨床意義在臨床上，血清ALP測(cè)定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。1.血清ALP活性升高肝膽疾?。?/p>

阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾?。河捎诠堑膿p傷或疾病使成骨細(xì)胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放進(jìn)入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。2.血清ALP活性降低

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比較少見(jiàn)，主要見(jiàn)于呆小病，ALP過(guò)少癥，維生素C缺乏癥。第12頁(yè)/共18頁(yè)思考題1.本次實(shí)驗(yàn)是用的什么方法？終止劑是什么？為什么加入鐵氰化鉀硼酸液后必須迅速混勻？有何影響？

答：終止法；終止劑是鐵氰化鉀硼酸液；硼酸改變了PH，使其不再處于最適PH。

B管與C管在實(shí)驗(yàn)中有何作用?不設(shè)兩管有何影響？

答：做參比溶液。

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程兩次水浴保溫，一次5min，一次15min。意義相同嗎？有何區(qū)別？

答：不同。前者是達(dá)到最適溫度，后者是反應(yīng)時(shí)間。4.用標(biāo)準(zhǔn)曲線如何設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程？第13頁(yè)/共18頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線法取試管按表操作加入物（ml)012345酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液00.20.40.60.81.0蒸餾水1.10.90.70.50.30.1碳酸鹽緩沖液1.01.01.01.01.01.0鐵氰化鉀溶液3.03.03.03.03.03.0相當(dāng)于金氏單位01020304050第14頁(yè)/共18頁(yè)立即混勻，選擇波長(zhǎng)510nm，用零號(hào)管調(diào)零，讀取各管吸光度，并與相應(yīng)酶金氏單位對(duì)應(yīng)，繪制校正曲線。其他方法：磷酸對(duì)硝基酚連續(xù)監(jiān)測(cè)法在堿性條件下，堿性磷酸酶將無(wú)色磷酸對(duì)硝基苯酚水解為黃色對(duì)硝基苯酚，在405nm測(cè)定對(duì)硝基苯酚生成的速率，這個(gè)速率與血清中ALP活性成正比。反應(yīng)需要Mg2+作為激活劑。

第15頁(yè)/共18頁(yè)實(shí)驗(yàn)小結(jié)

磷酸苯二鈉比色法水解速度快，故保溫時(shí)間較短。該法靈敏度較高，顯色穩(wěn)定，不需去蛋白，操作簡(jiǎn)單、快速。磷酸苯二鈉比色法水解速度快，故保溫時(shí)間較短。該法靈敏度較高，顯色穩(wěn)定，不需去蛋白，操作簡(jiǎn)單、快速。但與磷酸對(duì)硝基酚連續(xù)監(jiān)測(cè)法相比，準(zhǔn)確度、精密度較