艾滋病抗體檢測技術(shù)

艾滋病抗體檢測技術(shù)艾滋病抗體檢測技術(shù)第1頁HIV感染機制簡述

HIV在病毒分類中屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中人類免疫缺點病毒組。迄今為止，依據(jù)血清學反應和病毒核酸序列測定，全球流行HIV可分為2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型內(nèi)，依據(jù)編碼包膜蛋白env基因和編碼殼蛋白gag基因序列同源性又深入分為3個組：Ｍ組（主要組）、Ｏ組（外圍組）和Ｎ組（新組或非M非O組），Ｍ組內(nèi)又可分為Ａ-Ｊ10個亞型。在HIV-1型和HIV-2型之間,其核苷酸序列有45％-50%同源性，而且存在免疫交叉反應。應用免疫印跡法(Westblot)能夠?qū)⒍呙鞔_地域別開來。艾滋病抗體檢測技術(shù)第2頁HIV感染機制簡述HIV-1和HIV-2型即使都起源于非洲，但HIV不一樣型，不一樣組甚至不一樣亞型在全球流行是不均一。HIV-1O組，N組和HIV-2型只局限在非洲一些局部地域流行。而HIV-1M組病毒呈全球性流行。到當前為止，全球流行絕大多數(shù)毒株是HIV-1M組中A、C亞型毒株，接著是B亞型毒株，然后是A/E和A/G亞型重組毒株。深入分子流行病調(diào)查表明，在非洲幾乎流行了HIV全部亞型，但以A和C亞型為主，同時，也正因為眾多亞型共流行，那里也是發(fā)生病毒重組最多地方。在北美、歐洲和澳大利亞，B亞型依然是最常見亞型，即使M組其它幾個亞型、甚至O組病毒已經(jīng)在美國和歐洲幾個國家有報道，但深入現(xiàn)場流行病學調(diào)查證實，這些人中大多數(shù)是來自非洲移民。在南美，B亞型占有優(yōu)勢，但C、F亞型也有流行。在阿根廷和巴西有B/F重組毒株報道。在亞洲，好幾個不一樣HIV-1亞型流行于不一樣區(qū)域，在印度C亞型占主導，同時有A、B亞型共流行和A/C亞型重組毒株報道。在泰國則有二種獨立亞型流行，B亞型和E亞型（即A/E亞型重組毒株）。在我國主要以B、C和E亞型流行，但同時也A、F和HIV-2型報道。

艾滋病抗體檢測技術(shù)第3頁HIV感染機制簡述HIV病毒侵入人體后，其表面糖蛋白gp120與細胞表面受體蛋白CD4以高親和力結(jié)合，吸附到宿主細胞上；gp120再與宿主細胞表面輔助受體相互作用，使病毒與宿主細胞膜更靠近；gp41產(chǎn)生一系列構(gòu)象改變，其N端融合肽片段插入宿主細胞膜，造成病毒包膜與細胞膜最終融合，病毒RNA進入細胞。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測到病毒RNA、然后是p24抗原，最終是抗體。艾滋病抗體檢測技術(shù)第4頁HIV感染機制簡述在感染后10～14d內(nèi)，病毒RNA水平是呈指數(shù)上升，隨即下降并保持在連續(xù)穩(wěn)定水平上，進入HIV無癥狀期p24抗原水平伴隨病毒RNA水平發(fā)展而發(fā)展，在急性感染期就能夠出現(xiàn)，被認為是病毒復制間接標志，但因為檢測方法靈敏度不夠而使得其檢出時間要比RNA晚。艾滋病抗體檢測技術(shù)第5頁HIV感染機制簡述窗口期概念：從HIV感染到能夠檢測出HIV抗體這一時期,被稱作“窗口期”。在窗口期，只有經(jīng)過病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細胞水平來確定HIV感染。CD4淋巴細胞水平伴隨感染發(fā)展而逐步下降,當其在血液中細胞下降到200個/mm3時，就會發(fā)生嚴重免疫缺點，患者就被確診為艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4淋巴細胞水平能夠用來確定HIV感染、檢測病情發(fā)展。艾滋病抗體檢測技術(shù)第6頁HIV感染主要檢測方法當前檢測HIV方法有100各種，總體來說能夠分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。早期對HIV診療主要是經(jīng)過血清學試驗檢測抗HIV抗體,間接地診療HIV感染。病毒檢測包含p24抗原檢測、細胞培養(yǎng)(病毒分離)和病毒核酸檢測?？乖軌蛟趥€體感染后先于血清轉(zhuǎn)化2～18d被檢測到。所以，在血清轉(zhuǎn)化期經(jīng)過檢測p24抗原有著很大優(yōu)勢，能夠作為早期輔助診療HIV感染一個方法。艾滋病抗體檢測技術(shù)第7頁HIV感染主要檢測方法病毒培養(yǎng)是檢測HIV感染最準確方法。普通采取培養(yǎng)外周血單個核細胞(PBMC)方法進行HIV診療。在窗口期能夠檢測到病毒相關抗原或分離病毒。病毒核酸檢測通常是經(jīng)過檢測HIVRNA水平來反應病毒載量，含有很高靈敏度，使用適時熒光聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)，能夠在HIV感染前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測方法可用于HIV早期診療，如窗口期輔助診療、病程監(jiān)控、指導治療方案及療效測定、預測疾病進程等。當前常見測定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(RTPCR)、核酸序列擴增試驗(NASBA)、分支DNA雜交試驗(bDNA)等。近幾年，分子生物學方法不停被應用到HIV檢測中，HIV試驗室診療方法取得了很大進展，核酸檢測已經(jīng)成為了HIV試驗室診療發(fā)展方向。艾滋病抗體檢測技術(shù)第8頁HIV感染主要檢測方法抗體通常是在感染后3～8周能夠被檢測出來，在窗口期，病毒抗體不能被檢出?？贵w檢測由初篩和確認試驗組成，當前，大多應用雙抗原夾心法進行抗體篩查，這種方法含有很好靈敏性和特異性。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法有一定靈敏度，且操作簡單、快速，適合對大量樣品檢測，是當前臨床通用初篩檢測方法，初篩試驗呈陽性必須進行確認試驗。確證試驗國際上有3種確認試驗方法，包含免疫印跡試驗、條帶免疫試驗及免疫熒光試驗,當前以免疫印跡試驗最為常見。艾滋病抗體檢測技術(shù)第9頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法HIV抗體普通在人感染后數(shù)周逐步出現(xiàn),可延續(xù)至終生，95%在三個月能夠檢測出抗體。血清學試驗分為初篩和確認試驗。常規(guī)試驗方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡試驗(WestBlot)、間接免疫熒光法(IFA)?？焖贆z測方法：明膠顆粒凝集試驗、斑點免疫結(jié)合試驗、Ｐ24抗原檢測。最常見初篩試驗和確認試驗分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡試驗(WB)。艾滋病抗體檢測技術(shù)第10頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法常見HIV病原學檢測方法:病毒分離抗原檢測--Ｐ24抗原檢測核酸檢測（cDNA測定-PCR、RNA測定-病毒載量）其它方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測定、原位雜交常見HIV抗體檢測方法:ELISA

快速HIV檢測（RT）免疫印記法（WesternBlot）其它方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀艾滋病抗體檢測技術(shù)第11頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法酶聯(lián)免疫吸附試驗：ELISA法基礎原理是免疫反應物經(jīng)過化學或免疫學方法形成酶結(jié)合物，酶結(jié)合物能與待檢樣品中對應抗原或抗體結(jié)合成為免疫復合物,然后加入酶底物,經(jīng)酶催化或水解作用,無色底物產(chǎn)生顏色,用肉眼、分光光度計觀察結(jié)果。分類：雙抗原夾心法測抗體、雙抗體夾心法測抗原、間接法測抗體、競爭法、捕捉包被法等因為酶催化效率很高，間接地放大了免疫反應結(jié)果，使測定方法到達很高敏感度。艾滋病抗體檢測技術(shù)第12頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法ELISA結(jié)果判斷：試驗是否成立判斷：陰性對照（NC）和陽性對照（PC1，PC2）要求條件Cutoff值確實定灰區(qū)概念：把定量分析正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復試驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則匯報陽性，

灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)獻血員篩查尤為主要。高值鉤鐮效應（HD-HOOK）：在二位點夾心ELISA中，其劑量反應曲線高劑量（HIGH

DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀。產(chǎn)生該現(xiàn)象分子機理有"分子變構(gòu)說"和"濃度效應"等推論。一步法和二步法均存在，

只是前者出現(xiàn)更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，極少陰性結(jié)果。匯報：對HIV抗體篩查試驗，呈陰性反應者可出具“HIV抗體陰性”匯報,對初篩試驗呈陽性反應者不能出陽性匯報，可出具“HIV抗體待復查”匯報.艾滋病抗體檢測技術(shù)第13頁ELISA試驗影響原因試劑質(zhì)量--選擇質(zhì)量優(yōu)良檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。選擇靈敏度高，特異性好試劑。不一樣廠家出產(chǎn)試劑靈敏度與特異性存在一定差異，影響靈敏度原因：試劑平衡30分鐘：試劑沒有平衡或平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分，靈敏度顯著偏低。。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。試劑存放：試劑在室溫放置24小時后靈敏度開始下降，放置時間越長、室溫溫度越高靈敏度下降越顯著；試驗過程中任何一步縮短時間靈敏度都顯著下降，假如同時縮短每一步反應時間靈敏度下降更顯著超出使用期試劑靈敏度顯著下降，超出時間越長下降越顯著。艾滋病抗體檢測技術(shù)第14頁ELISA試驗影響原因標本質(zhì)量：最好將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標本為血漿：必須使用含抗凝劑血液標本搜集管，采血后必須馬上顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃低溫冰箱內(nèi)。干擾物質(zhì)影響，大約40%人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，能夠不一樣程度影響檢測結(jié)果；常見干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標識二抗FC段法結(jié)合造成假陽性，高濃度AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會造成本底過深影響檢測結(jié)果。溶血標本及混有紅細胞血清采取ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性

可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細胞或血紅蛋白中亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，會釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性有色物質(zhì)，即顯藍色，產(chǎn)生假陽性。艾滋病抗體檢測技術(shù)第15頁ELISA試驗影響原因標本質(zhì)量：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，所以，被細菌污染標本同溶血標本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。在冰箱中保留過久標本，在間接法ELISA測定中會造成本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定血清標本宜為新鮮采集；如不能馬上測定，5d內(nèi)測定血清標本可存放于4℃，1周后測定血清標本應低溫凍存；凍存后融解標本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性

最好使用真空采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留個別纖維蛋白原，在ELISA測定過程中能夠形成肉眼可見纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；所以血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。

艾滋病抗體檢測技術(shù)第16頁ELISA試驗影響原因加樣：加樣不可太快，要防止加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法確保微量加樣準確性和均一性。加在孔壁上部非包被區(qū)，易造成非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應液界面有差異。所以，有時候一份標本用相同試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑錯誤所致。手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等候時間過長(尤其是室內(nèi)溫度較高時)；全自動酶標儀也存在一樣問題，孵浴時間差距較大。標本較多時，請分批操作。吸量不準確，直接影響檢測結(jié)果。所以加樣器也要經(jīng)常清洗，定時校準。加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。加樣次序艾滋病抗體檢測技術(shù)第17頁ELISA試驗影響原因孵浴：溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵一個原因?？乖贵w結(jié)合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不一樣，造成周圍與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在顯著差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，降低受熱不均，貼密封膜，預防污物浸入和水分蒸發(fā)。孵育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；孵育時間人為延長，造成非特異性結(jié)合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底。艾滋病抗體檢測技術(shù)第18頁ELISA試驗影響原因洗板：是ELISA操作主要步驟，手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，全自動洗板機使用不妥也會影響結(jié)果，血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液析出結(jié)晶易使洗板機針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標識酶洗脫不徹底，抽吸不完全；洗板不暢，造成洗板效果差。造成“花板”造成假陽性或假陰性；洗液量不足，確保洗液注滿各孔。采取手工洗板,孔與孔之間液體交叉。采取半自動洗板機洗板時，洗液量不足，造成洗板不徹底；反應板過多造成洗板等候時間長。及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標識物吸水紙一定要棄去，不然可能影響試驗結(jié)果。

艾滋病抗體檢測技術(shù)第19頁ELISA試驗影響原因顯色：普通來說，顯色時間過短，結(jié)果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑；尤其是國產(chǎn)試劑。盡可能臨用時配置。堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色TMB顯色劑不用；加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。終止：加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，造成假陽性增加。艾滋病抗體檢測技術(shù)第20頁ELISA試驗影響原因讀板：單波長或雙波長比色選擇問題。所謂單波長比色即是通常以對顯色含有最大吸收波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色吸光度值為零，此時測得吸光度即為臟物吸光度值。最終酶標儀給出數(shù)值為敏感波長下吸光度值與非常感波長下吸光度值差。所以，雙波長比色測定含有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標本非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度影響優(yōu)點。因為ELISA測定中單個空白孔非特異吸收上有一定程度不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置不一樣都有可能得到不一樣吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。

艾滋病抗體檢測技術(shù)第21頁ELISA試驗中常見問題顯色淡，靈敏度偏低：試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高試劑盒未充分平衡培養(yǎng)箱溫度不足37℃保溫時間不足洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數(shù)增加移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔漏加試劑或底物作用時間不足艾滋病抗體檢測技術(shù)第22頁ELISA試驗中常見問題背景深，全部呈有色：洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成份殘留或酶標識物殘留樣品污染培養(yǎng)箱溫度超出37℃或反應時間過長吸嘴重復使用，未洗凈或消毒不徹底酶等試劑混用一次試驗標本量過多，加樣時間太長，造成實際反應時間延長艾滋病抗體檢測技術(shù)第23頁ELISA試驗中常見問題出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色顯色液變質(zhì)洗滌液配制有誤--按說明書所表示稀釋倍數(shù)配制未加酶結(jié)合物終止液誤作洗滌液稀釋或當?shù)孜镆菏褂冒滩】贵w檢測技術(shù)第24頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法初篩用HIVELISA試劑當前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測試劑。第一代試劑主要以病毒裂解物或個別純化病毒抗原包被反應板,以檢測血清中抗體。因為包被抗原不很純,假陽性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到重組抗原和合成肽包被反應板，因為純化抗原使用,特異性有了很大提升。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測抗體,深入提升了敏感性。第四代試劑則在第三代基礎上深入增加了P24抗原檢測,把HIV抗原和抗P24抗體同時包被反應板,可同時檢測血清中HIV抗體和P24抗原。當前我國主要使用第三代艾滋病抗體檢測技術(shù)第25頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法HIV抗體篩查試驗基礎要求：篩查試劑必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊同意、批檢合格、臨床評定質(zhì)量優(yōu)良、在使用期內(nèi)試劑。提議采取國家參比室試劑考評質(zhì)量優(yōu)良試劑。--中國疾病預防控制中心性艾中心網(wǎng)站艾滋病抗體檢測技術(shù)第26頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法免疫印跡試驗：免疫印跡試驗主要用于確認試驗，基礎原理是HIV全病毒抗原經(jīng)過SDSPAGE電泳,將分子量大小不等蛋白帶分離開來,然后再把這些已經(jīng)分離不一樣蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100,再把它直接加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應,血清中若含有抗HIV抗體,就會與膜條上抗原帶相結(jié)合。加入抗人IgG酶結(jié)合物和底物后,即可使有反應抗原抗體結(jié)合帶展現(xiàn)紫褐色,依據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果有匯報說，免疫印跡試驗特異性不是很好,有大約2％假陽性率，但免疫印跡試驗依然是當前最常見HIV確認試驗。艾滋病抗體檢測技術(shù)第27頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診療感染HIV，嬰幼兒體內(nèi)從母親得到HIV抗體連續(xù)存在時間最長不超出18個月。在18月齡以前能夠用各種不一樣非抗體依賴性檢驗方法對新生兒HIV感染進行輔助診療，包含：HIVP24抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測定。18月齡以前嬰幼兒感染HIV診療要結(jié)合臨床表現(xiàn)和試驗室綜合診療。艾滋病抗體檢測技術(shù)第28頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法免疫熒光試驗(IFA)：基礎原理為采取熒光染料CalcienAM標識Ｈ9或HUT78培養(yǎng)細胞作為載體,用HIV感染細胞,該細胞內(nèi)就會含有HIV抗原,將HIV感染淋巴細胞涂于玻片上,固定，制備為抗原片加入待檢血清，待檢血清中抗HIV抗體與抗原結(jié)合后,再與熒光素標識抗人Ig結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見到細胞內(nèi)有黃綠色熒光。艾滋病抗體檢測技術(shù)第29頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法明膠顆粒凝集試驗(PA)：PA基礎過程是先將樣品稀釋,然后分別加入經(jīng)抗原致敏和未致敏明膠顆粒,混勻后保溫(普通為室溫)。當血清中有HIV抗體存在時,經(jīng)抗原致敏明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應,依據(jù)明膠顆粒在孔中凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡便,無需特殊儀器設備,適合對少許標本檢測。艾滋病抗體檢測技術(shù)第30頁（PA）檢測結(jié)果判定艾滋病抗體檢測技術(shù)第31頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法斑點EIA或稱斑點ELISA（dot-EIA）：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10min以內(nèi)，使用抗原量少。艾滋病抗體檢測技術(shù)第32頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法膠體金（或膠體硒）快速試驗金標紙條采取雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經(jīng)純化基因工程制備gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。當待檢標本中含有HIV抗體時，先和金標識抗原結(jié)合，因為層析作用反應復合物沿硝酸纖維膜向前移動，當碰到包被抗原時，形成Ag-Ab-Ag-Au復合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時在包被膜上還有一條質(zhì)控線對照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。艾滋病抗體檢測技術(shù)第33頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法膠體金（或膠體硒）快速試驗試劑穩(wěn)定，可室溫長久保留。試驗時不需任何設備，快速、簡便、特異性很好，敏感性約相當于中度敏感ELISA，適合用于應急檢測、門診急診個體檢測，尤其是基層單位。當前已經(jīng)有在我國被SFDA同意注冊國外進口試劑和我國產(chǎn)品。普通可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。艾滋病抗體檢測技術(shù)第34頁反應艾滋病抗體檢測技術(shù)第35頁金標法（膠體硒法）結(jié)果判定艾滋病抗體檢測技術(shù)第36頁當前常見HIV抗體、抗原檢測方法艾滋病唾液檢測卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時檢測含在唾液中HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中HIVIgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可防止靜脈穿刺。但樣品預處理時間長且售價較高。以唾液為樣品測定HIV抗體ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國FDA同意。艾滋病抗體檢測技術(shù)第37頁快速HIV檢測與ELISA-HIV檢測比較快速* 平均45分鐘 （10分鐘－2.5小時）常規(guī) 平均3.5小時 （94分鐘－16小時）*普通不要特殊設備，試劑可不用冰箱存放艾滋病抗體檢測技術(shù)第38頁快速試劑不足普通不用于血液篩查有一定假陽性反應，如作為臨床診療，要復檢和確認有一定假陰性反應（尤其暴露時間<3個月）艾滋病抗體檢測技術(shù)第39頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

細胞培養(yǎng)方法檢測HIV專一性強，不會出現(xiàn)假陽性，對于確認那些抗原/抗體檢測不確定個體和陽性母親新生兒是否感染HIV有著主要意義。不過須要有一定數(shù)量感染細胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性差、操作時間長、操作復雜，必須在特定P3試驗室中才能進行，且費用較高(每次培養(yǎng)需要約200～500美元)，不適合用于臨床。艾滋病抗體檢測技術(shù)第40頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

p24抗原檢測能夠在病毒開始復制后檢測到血液中可溶性p24抗原，檢測p24抗原縮短窗口期（可提前1-2周），最早可達9天。HIV-P24抗原陽性僅作為HIV感染窗口期輔助診療依據(jù)，檢測早期感染，不能據(jù)此確診。易出現(xiàn)假陽性。陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗確認，該結(jié)果才可作為HIV感染輔助診療依據(jù)。HIV1p24抗原檢測陰性，只表示在本試驗中無反應，不能排除HIV感染。艾滋病抗體檢測技術(shù)第41頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

病毒核酸檢測方法含有很高靈敏度，對疾病進展監(jiān)測、抗病毒療效觀察和耐藥性監(jiān)測非常主要。不過，因為HIV基因多樣性，沒有一套引物能夠覆蓋全部HIV序列，使檢測敏感性又受到限制；現(xiàn)有病毒核酸檢測方法或是檢測儀器、檢測試劑昂貴，檢測1次病毒載量需要上千元(約1500元)，或是操作復雜，對操作人員要求高，既難以在普通試驗室推廣，又不適合用于對大量患者快速檢測，一樣不適合廣泛臨床應用。艾滋病抗體檢測技術(shù)第42頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

基困芯片應用于HIV檢測得到快速發(fā)展，基因芯片技術(shù)廣泛用于HIV病毒測序、分型及多態(tài)性分析用基因芯片技術(shù)對HIV等傳染病病毒進行檢測時，1毫升血液中只要含有100個病毒顆粒即可得出結(jié)論，而以前檢測方法要等到血液中病毒顆粒到達1萬甚至10萬才能奏效。該技術(shù)較為復雜，且成本高，當前對其應用仍大多停留在試驗階段，離臨床檢驗及疾病診療普及性還有一段距離。艾滋病抗體檢測技術(shù)第43頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

總而言之各種試驗方法能夠依據(jù)HIV感染不一樣時期與狀態(tài)選擇不一樣檢測伎倆。HIV原發(fā)感染2周內(nèi)，任何方法均無法檢測到病毒，2周后出現(xiàn)病毒血癥時，可檢測病毒抗原，感染6周~8周后能夠選擇檢測抗體方法。利用PCR技術(shù)可用來追蹤HIV自然感染史；可用來監(jiān)測長久潛伏期患者；以及在抗病毒治療期間病毒載量水平；也可用于HIV血清陽性母親嬰兒HIV檢測。在嬰兒出生后最初6個月~9個月期間。他們血清中存在母體抗體，所以用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。艾滋病抗體檢測技術(shù)第44頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展就當前而言，標準檢測方法是血清學HIV抗體檢測，它是診療艾滋病感染者和艾滋病主要指標和標準檢測項目，分子生物芯片等更新檢測技術(shù)可能會廣泛應用于HIV檢測咱們應親密注視檢測技術(shù)發(fā)展，以更準確、快速方法對HIV感染作出診療。所以，既要提升檢測敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡便、快速和降低成本已成為HIV檢測技術(shù)發(fā)展要求和方向，很多研究正致力于尋找病毒檢測替換技術(shù)。艾滋病抗體檢測技術(shù)第45頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展

多年來，HIV檢測技術(shù)取得了很大進展。如發(fā)展了ICDp24抗原測定法(immunecomplexdisassociate，免疫復合物解離，ICD)，將免疫復合物熱解離后經(jīng)過TSA信號放大系統(tǒng)使用ELISA進行檢測，使p24抗原檢測最小檢出值由原來10pg/ml降低到0.5pg/ml，在HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期診療中與RNA檢測相當，與HIV核酸檢測含有可比性，含有主要實用價值。第四代HIV檢測試劑、超敏感EIA、線性免疫酶測定(linealimmunoenzymaticassay)等，使檢測出HIV感染時間大大提前。艾滋病抗體檢測技術(shù)第46頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展窗口期問題：窗口期是從被感染到身體產(chǎn)生足夠多特定抗體這段時間，“足夠多”是指能被咱們當前測試伎倆檢測出來。人被感染后身體會制造抗體來反抗病毒，當身體產(chǎn)生足夠多抗體后，抗體測試將呈陽性。不一樣人對病毒感染反應有一點差異，以至于不一樣人“窗口期”長度也有微小改變。關于窗口期到底有多長問題，當前醫(yī)學界存在很多爭論，有說6—8周，也有說3個月，最保守說法是6個月！我國比較認同說法是3個月，HIV抗體窗口期存在只能縮小但無法防止。艾滋病抗體檢測技術(shù)第47頁當前HIV檢測技術(shù)優(yōu)缺點和進展提升檢測試劑靈敏度：新試劑研發(fā)病毒相關抗原或病毒分離：第四代試劑應用，核酸檢測在發(fā)達國家進行血液篩查被普遍應用。德國NAT使HIV殘余危險度由1：277萬降低到1：554萬，法國由1：307 萬下降到：315萬（對多份標本進行混合集合，RT-PCR方法檢測，對陽性集合進行拆分）窗口檢疫期（血漿制品—90天）艾滋病抗體檢測技術(shù)第48頁

HIV抗體檢測試劑發(fā)展

從1985年第1代HIV抗體檢測試劑問世到現(xiàn)在，HIV血清學檢測試劑已經(jīng)發(fā)展到了第4代。第4代ELISA試劑優(yōu)點在于能同時檢測抗原和抗體，降低血源篩查殘余危險度。與第3代抗HIV1/2試劑相比，檢出時間提前了4～5d，窗口期縮短了1周多，在對艾滋病早期診療效果上顯著優(yōu)于第3代。艾滋病抗體檢測技術(shù)第49頁HIV抗體檢測試劑發(fā)展但使用第4代試劑對艾滋病毒進行檢測，依然有2～3周窗口。另外，因為把抗原和抗體同時包被在反應板上，存在著相互干擾可能，影響了免疫反應特異性。普通來講，使用第4代試劑檢測p24抗原，其靈敏度(20～100pg/mL)遠遠低于單獨檢測抗原抗體分析法(3.5～10pg/mL)。從方法學上來講，這種基于ELISA分析方法，靈敏度終究是有限。相對化學發(fā)光和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)等更先進分析方法，它靈敏度比較低。由此可見，提升敏感性、特異性、縮短窗口期和簡便快速是HIV檢測試劑未來發(fā)展主要趨勢。艾滋病抗體檢測技術(shù)第50頁p24抗原檢測方法研究進展伴隨檢測靈敏度不停提升，p24抗原檢測逐步從主要用于在窗口期輔助早期診療和深入縮短窗口期，發(fā)展到用于病毒載量測定。當前，p24抗原在以下幾方面都有主要應用：HIV1抗體不確定或窗口期輔助診療；HIV1抗體陽性母親所生嬰兒早期輔助判別診療；第4代HIV1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應，但HIV1抗體確認陰性者輔助診療；監(jiān)測病程進展和抗病毒治療效果。但現(xiàn)有監(jiān)測病程進展和抗病毒治療效果均采取昂貴、操作復雜病毒RNA測定方法。我國HIV/AIDS患者絕大個別是在基層，極難在基層普及，對疾病治療和控制很不利。高靈敏度p24抗原檢測方法建立成為在發(fā)展中國家使用病毒載量測定方法一個選擇。艾滋病抗體檢測技術(shù)第51頁p24抗原檢測方法研究進展年，來自HIV病毒發(fā)覺者之一美國