化學(xué)發(fā)光分析法

化學(xué)發(fā)光分析法第1頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基本原理常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)儀器裝置影響化學(xué)發(fā)光的因素定性定量分析第2頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）：又稱(chēng)為冷光，它是在沒(méi)有任何光、熱或電場(chǎng)等激發(fā)的情況下由化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的光輻射。由于不需要外源性激發(fā)光源，避免了背景光和雜散光的干擾，降低了噪聲，大大提高了信噪比。具有靈敏度高，線性范圍寬，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，分析快等特點(diǎn)。在生物工程學(xué)，藥物學(xué)，分子生物學(xué)，臨床和環(huán)境化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域正顯示出它蓬勃的生機(jī)。第3頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、基本原理化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：顧名思義，伴隨著光輻射發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，成為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光劑：在不同的化學(xué)反應(yīng)中，可以和多種不同的組分反應(yīng)并發(fā)生能量交換，生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象的試劑常被成為化學(xué)發(fā)光劑。它們可以是氧化劑、還原劑、某些能生成自由基的物質(zhì)。第4頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)制

在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，某些反應(yīng)產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能，由基態(tài)躍遷至較高電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同能級(jí)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或內(nèi)轉(zhuǎn)換到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級(jí)，由此以輻射的形式放出能量躍回到基態(tài)。在個(gè)別情況下，它可以通過(guò)系間躍遷到達(dá)亞穩(wěn)的三重態(tài)，然后再回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，并產(chǎn)生光輻射，這兩種光都是化學(xué)發(fā)光。

A+B=C+D*（激發(fā)態(tài)分子）D*→D+h（激發(fā)態(tài)分子D*的光輻射）第5頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件能快速地釋放出足夠的能量。能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)，E=170～300kJ/mol；發(fā)光位于可見(jiàn)光區(qū)；處于激發(fā)狀態(tài)的分子或原子必須能夠放出光子，或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量到另一個(gè)分子上而使此分子被激發(fā)。第6頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光效率：化學(xué)效率：發(fā)光效率：

化學(xué)效率主要取決于發(fā)光所依賴(lài)的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率則取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。第7頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一發(fā)光強(qiáng)度

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度Icl是以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示，它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)。時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：

如果反應(yīng)是一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Icl與該時(shí)刻的分析物濃度c成正比，即化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度與分析物濃度c成線性關(guān)系。在化學(xué)發(fā)光分析中，常用已知時(shí)間內(nèi)的發(fā)光總強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量分析。第8頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光劑和化學(xué)發(fā)光體系魯米諾過(guò)氧化草酸酯酸性高錳酸鉀四價(jià)鈰吖啶酯化合物第9頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一魯米諾早在1853年就被合成出來(lái)了。1928年，化學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)這種化合物有一個(gè)奇妙的特性，它被氧化時(shí)能發(fā)出藍(lán)光。刑偵學(xué)應(yīng)用在檢驗(yàn)血痕時(shí)，魯米諾與血紅素（hemoglobin，血紅蛋白中負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧的一種蛋白質(zhì)）發(fā)生反應(yīng)，顯出藍(lán)綠色的熒光。這種檢測(cè)方法極為靈敏，能檢測(cè)只有百萬(wàn)分之一含量的血。簡(jiǎn)介第10頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一魯米諾(luminol)

（又名發(fā)光氨）

化學(xué)名稱(chēng)為3-氨基鄰苯二甲酰肼。常溫下是一種黃色晶體或者米黃色粉末，是一種比較穩(wěn)定的人工合成的有機(jī)化合物化學(xué)式為C8H7N3O2溶液顯強(qiáng)酸性，對(duì)眼睛、皮膚、呼吸道有一定刺激作用。第11頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一魯米諾發(fā)光原理第12頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一合成3-硝基鄰苯二甲酸+肼H2O+3-硝基鄰苯二甲酰肼保險(xiǎn)粉(強(qiáng)還原劑）3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)高沸點(diǎn)溶劑（如二甘醇）縮合反應(yīng)

還原第13頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一發(fā)光體系魯米諾-H2O2體系魯米諾-KIO4體系第14頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一魯米諾-H2O2的反應(yīng)是自身化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在PH=11的水溶液中發(fā)光效率最大魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了一個(gè)雙負(fù)離子（Dianion），它可被過(guò)氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過(guò)氧化物。該過(guò)氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)?，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(zhǎng)位于可見(jiàn)光的藍(lán)光部分第15頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一應(yīng)用直接作用：增敏和抑制作用過(guò)渡金屬：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+

維生素B6，維生素B12，維生素C，嗎啡，可待因，腎上腺素，多巴胺，細(xì)胞色素間接作用如Fe2+對(duì)魯米諾-H2O2體系有催化增敏作用，而蛋白質(zhì)卻抑制此作用，據(jù)此可建立檢測(cè)血清中蛋白質(zhì)含量的方法。酶在體系中加入辣根過(guò)氧化物酶等，利用其對(duì)底物的酶解并生成H2O2的反應(yīng)，可測(cè)定酶含量、底物含量或H2O2含量。第16頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一魯米諾-KIO4體系

催化作用如Co2+,Mn2+,維生素C1)利用該體系可測(cè)定樣品中這些組分

2)利用Mn2+對(duì)該體系的催化作用來(lái)測(cè)定水中的IO4-在PH=12~13的水溶液中，體系發(fā)光效率最大第17頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一在免疫分析中的應(yīng)用將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原或抗體上免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶作用于發(fā)光底物目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)第18頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一該分析系統(tǒng)采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析第19頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

過(guò)氧化草酸酯（鹽）自身并不發(fā)光，氣化學(xué)發(fā)光均為敏華化學(xué)發(fā)光。原理：芳香草酸酯的過(guò)氧化氫的氧化作用，芳香草酸鹽和H2O2反應(yīng)形成過(guò)氧草酰中間體，當(dāng)該中間體與蒽類(lèi)衍生物等熒光劑接觸時(shí)，會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的所加熒光劑特有的熒光。簡(jiǎn)介第20頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第21頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第22頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一過(guò)氧化草酸酯的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系（1）草酸酯-過(guò)氧化氫-蒽類(lèi)衍生物體系：迄今發(fā)現(xiàn)的效率最高的非生物化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系。由于蒽類(lèi)衍生物的脂溶性較強(qiáng)，所以反應(yīng)體系的溶液中通常會(huì)加入一定量的有機(jī)溶劑或表面活性劑。蒽的衍生物:9,102二苯基蒽,9,102二苯乙炔基蒽[5,6]及其取代衍生物[7～9]等。除此之外,還有萘[10]和聚酰亞胺[11,12]的取代衍生物。

第23頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）草酸酯-H2O2體系：主要用于測(cè)定那些酶反應(yīng)產(chǎn)物為H2O2的酶底物，如葡萄糖、氨基酸等。

改變H2O2用量，對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度影響不大，由于H2O2具有易分解性質(zhì)，一般H2O2用量為草酸酯3~4倍。第24頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）草酸酯-過(guò)氧化氫-熒光待測(cè)物體系：用于測(cè)定某些具有熒光或其衍生物具有熒光的組分進(jìn)行分析測(cè)定，如環(huán)孢素A、兒茶酚胺、類(lèi)固醇、地塞米松等。第25頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酸性高錳酸鉀

具有很強(qiáng)的氧化能力，可以與多種無(wú)機(jī)物和有機(jī)物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，但由于其反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度較弱，所以知道20世紀(jì)70年代以后，伴隨著微弱光檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展才得到廣泛的研究和應(yīng)用。第26頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酸性高錳酸鉀體系（1）高錳酸鉀-待測(cè)物體系

酸性介質(zhì)中，該體系可直接測(cè)定二氧化硫、丁丙諾非、對(duì)氨基苯甲酸酯類(lèi)麻醉劑、腎上腺素、維生素C、5-羥色胺、可待因等組分。（2）高錳酸鉀-甲醛-待測(cè)物體系

可以對(duì)甲胺嘌呤、雙氯芬酸、氨基比林、L-色氨酸、碘、酪氨酸等組分進(jìn)行檢測(cè)。（3）高錳酸鉀-連二亞硫酸鈉-待測(cè)物體系

可測(cè)定維生素B6、利血平、胡延索乙素、核黃酸等組分。第27頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四價(jià)鈰

可直接與多種還原性無(wú)機(jī)物或者有機(jī)物放生氧化還原反應(yīng)，是強(qiáng)氧化性化學(xué)發(fā)光劑之一。發(fā)光體系雖然簡(jiǎn)單，但由于不收Cl-的影響，更合適水樣中有機(jī)物污染的檢測(cè)。第28頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四價(jià)鈰體系（1）鈰-待測(cè)物體系

可用于檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚、色氨酸。（2）鈰-聯(lián)苯三酚-氧體系

可檢測(cè)環(huán)境水樣中的溶解氧。（3）Ce4+-SO32--體系

利用某鞋熒光性有機(jī)物對(duì)其的增敏作用，可以測(cè)定奎寧、奎寧丁、辛可丁、膽汁酸和多種皮質(zhì)類(lèi)固醇、甾族化合物。（4）Ce4+-RhB（羅丹明B）-還原性待測(cè)物體系

用于測(cè)定葉酸、巰嘌呤、維生素C（鹽）和噻唑類(lèi)席夫堿。（5）Ce4+-Ru（phen）32+（二價(jià)釕-鄰菲啰啉配合物）體系

可用于草酸、丙酮酸、維生素C、枸櫞酸、酒石酸、戊二醛和部分氟代喹諾酮衍生物的測(cè)定。第29頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一吖啶酯化合物：該化合物是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)發(fā)光劑之一。代表性物質(zhì)為光澤精，在堿性介質(zhì)中，光澤精-H2O2金屬離子、還原性化合物以及產(chǎn)生H2O2基質(zhì)或酶的測(cè)定。第30頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三儀器裝置第31頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第32頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測(cè)器信號(hào)放大器顯示與記錄

發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動(dòng)注射的方式進(jìn)行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合，測(cè)最大光強(qiáng)度或總發(fā)光強(qiáng)度；試樣量小，重復(fù)性差；

流動(dòng)注射方式：用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過(guò)測(cè)量室，連續(xù)發(fā)光，測(cè)定最大光強(qiáng)度；試樣量大；第33頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一化學(xué)發(fā)光儀第34頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一LUM-F流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀器第35頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第36頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、影響化學(xué)發(fā)光的因素化學(xué)發(fā)光體系的選擇PH反應(yīng)體系中各試劑的濃度樣品溶液中的共存組分化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度（光量子數(shù)）決定于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的各個(gè)過(guò)程，所以組成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的各個(gè)因素都將影響待測(cè)物的測(cè)定。第37頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（一）化學(xué)發(fā)光體系的選擇

化學(xué)發(fā)光體系主要包括化學(xué)發(fā)光劑，與化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)的試劑、催化劑、增敏劑、緩沖劑、溶劑等。第38頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一依據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)，選擇相適應(yīng)的化學(xué)發(fā)光體系

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)(1)

如果待測(cè)組分能直接與強(qiáng)氧化劑反應(yīng)，可選擇強(qiáng)化氧化性化學(xué)發(fā)光劑-待測(cè)物體系，如：KMnO4-待測(cè)物、KIO4-待測(cè)物、Ce4+-待測(cè)物等。

第39頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一依據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)，選擇相適應(yīng)的化學(xué)發(fā)光體系

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)(2)

如果待測(cè)物能夠直接與H2O2反應(yīng)或其參與的酶促反應(yīng)改變了H2O2的含量，可選擇魯米諾-H2O2體系、草酸酯-過(guò)氧化氫-蒽類(lèi)衍生物體系，或者光澤精-H2O2體系。第40頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一如果是建立新的發(fā)光體系，則以簡(jiǎn)單、高效為原則。首先考慮化學(xué)發(fā)光劑-待測(cè)物體系，確定測(cè)量波長(zhǎng)。然后對(duì)體系的溶劑、緩沖劑進(jìn)行篩選，最后再篩選催化劑和增敏劑。第41頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）PH不同的反應(yīng)體系需要不同的PH條件，其最佳值可通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度-pH的關(guān)系曲線確定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以最終確定緩沖體系的組成，使體系的化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度相對(duì)較大。第42頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）反應(yīng)體系中各試劑的濃度

除待測(cè)物以外，反應(yīng)體系中所有試劑都要通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度—濃度的關(guān)系曲線找出最佳使用濃度范圍，并最終確定各試劑的濃度。第43頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）樣品溶液中的共存組分干擾組分對(duì)發(fā)光的影響可以是增敏的效果，也可以是猝滅的作用。通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查和測(cè)定樣品溶液中可能存在的，對(duì)化學(xué)發(fā)光有影響的干擾組分，尋找其消除方法。第44頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一五、定性定量分析化學(xué)發(fā)光法是一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的痕量分析方法。在一定的條件下，化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度（或光量子數(shù)）與待測(cè)組分的濃度成正