個(gè)樣本細(xì)菌基因組掃描結(jié)題報(bào)告

目錄一、項(xiàng)目信 二、工作流 IlluminaMiseq實(shí)驗(yàn)流 2.1.1流 流程說 生物信息分析流 三、項(xiàng)目結(jié)果報(bào) 原始數(shù)據(jù)說 原始數(shù)據(jù)質(zhì) 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量剪 數(shù)據(jù)統(tǒng) 組組 rRNA/tRNA查 預(yù) 功能注 各數(shù)據(jù)庫結(jié)果匯總 COG功能分 KEGG通路分 GO注釋統(tǒng) 四、附 附件說 文件解壓縮方 文件打開或?yàn)g覽方 一 項(xiàng)目信沈陽市沈河區(qū)文化路72-項(xiàng)目2015 二 工作流2.1.1流DNA→→片段化→→文庫構(gòu)建→→PCR→→IlluminaMiseq流程說 組DNA收完成組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)收集組DNA 組DNA片段化約400~500bpDNAA&B瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B試劑：TruSeq?DNASamplePrepKit 另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成" (bridge)PCRDNADNAMiseq加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP將"熒光基團(tuán)"和"終止基團(tuán)"化學(xué)切割，恢 3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸DNA片段的序列。試劑：TruseqSBSKitv3-HS（200cycles）本項(xiàng)目涉及到的生物信息學(xué)分析內(nèi)容見下表（√打勾部分√COG注√√GO注√√KEGG注√√√N(yùn)r注√三 項(xiàng)目結(jié)果報(bào)本項(xiàng)目采用IlluminaMiseq技術(shù)完成菌株的組掃描，構(gòu)建了IlluminaPE文庫（500bp文庫），F(xiàn)ASTQ文件為最原始的數(shù)據(jù)文件，文件包含read的序列信息以及質(zhì)量信息。FASTQ文件格式如下所示：@HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCT+HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946開頭；第三行中ID可以省略，但“+”不能省略），第二行為read的堿基序列，第四行是第二行中序列的每個(gè)堿基所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量值。為方便保存和共享各產(chǎn)生的高通量數(shù)據(jù)，NCBI數(shù)據(jù)中心建立了大容量的數(shù)據(jù)庫SRA（SequenceReadArchive, 通過生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，對(duì)所有reads的每個(gè)circle進(jìn)行堿基分布和質(zhì)量波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)，可以直觀的反映出樣本的質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量。下面是本項(xiàng)目IlluminaMiseq原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控圖：分別為原始數(shù)據(jù)堿基組成分布圖（又稱為GC偏差圖）和原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布圖。3-1原始數(shù)據(jù)堿基組成分布例注：橫坐reads堿基坐標(biāo)，縱坐標(biāo)是所有readsA、C、G、T、N堿基分別占的百分比。每個(gè)位置上，A、C、G、T在開始有所波動(dòng)，后面會(huì)趨于穩(wěn)定。一般情況下A與T相等，C與G相等，各堿基所占百分比會(huì)因物種差異而不同。組項(xiàng)從上圖可知，該文庫堿基分布均勻，N3-2原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布例注：橫坐標(biāo)reads堿基坐標(biāo)，縱reads的堿基質(zhì)量（SolexaScale40=Highest15=Lowest），圖中垂直紅線”Ⅰ”指定的范圍是所有reads堿基的綜合質(zhì)量，紅色垂直方塊是質(zhì)量的四分位值范圍，加黑粗線是質(zhì)量值的中位數(shù)。采用lluminaMieq技術(shù)對(duì)樣品的DNA進(jìn)行paied-end(PE)建500bp于Illuminaieq的原始數(shù)據(jù)會(huì)存在一些質(zhì)量比較低的數(shù)據(jù)，為了使后續(xù)的組裝更加準(zhǔn)確，會(huì)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切，具體步驟如下：5’A、G、C、T修剪質(zhì)量較低的reads末端(質(zhì)量值小于舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長(zhǎng)度小于25bp對(duì)經(jīng)過質(zhì)量剪切前后的數(shù)據(jù)分別進(jìn)序reads數(shù)、reads讀長(zhǎng)、總堿基數(shù)、文庫平均插入長(zhǎng)度、Q20%、平表3-1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Raw Raw

Clean Clean Clean pair totalbases pair single totalbases 首先，利用SOAPdenovov2.04（/）Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果。其次，運(yùn)用GapCloserv1.12軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部?jī)?nèi)洞填充和堿基校正。3-3SOAPdenovo組裝算法原理示意圖(LietalGenomeRes從而選擇K-mer為35的結(jié)果作為最終的組裝結(jié)果。最終組裝結(jié)果的統(tǒng)計(jì)如下表所示：3-2組裝結(jié)果各指標(biāo)統(tǒng)No.ofall Basesinall No.oflargescaffords(>1000 Basesinlarge Largest 292790Scaffold128892Scaffold43840G+CNNo.ofallBasesinallNo.oflargecontigs(>1000BasesinlargeLargest292790ContigContig注：N50、N90長(zhǎng)度的概念：將各個(gè)序列按長(zhǎng)度大小排序，從大至小逐一掃描各個(gè)序列的長(zhǎng)度值，進(jìn)行累加，當(dāng)該累加值第一次超過所有序列總長(zhǎng)的50%時(shí)，此時(shí)掃描到的序列，其長(zhǎng)度值即N50值，N90值亦同理。N50、N90長(zhǎng)度值比Contig：群，拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)而拼在一起的序列，中間沒有Gap在一起形成的更長(zhǎng)序列，即為scaffold，中間可能有Gap(NNNNN……)分別利用Barrnap0.4.2和tRNAscan-SEv1.3.1軟件對(duì)組中包含的rRNA和tRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見3-3tRNA預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)例tRNAAnti3-4rRNA預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)例+利用Glimmer3.02（ ）軟件進(jìn)行細(xì)菌的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果文件詳見附件predict下的*.predict，預(yù)測(cè)的核苷酸序列詳見附件predict下的*ffn，對(duì)應(yīng)的氨基酸文件詳見附件predict下的*faa。預(yù)測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)見下表，分別為數(shù)量，總長(zhǎng)度，GC含量，占組百分比，平均長(zhǎng)度，間區(qū)長(zhǎng)度，間區(qū)GC含量及間區(qū)占組百分比等。表3-5信息統(tǒng)計(jì)Gene Genetotal Geneaverage926Gene0.926genesperGCcontentingeneIntergeneticregion856467GCcontentinintergenetic各數(shù)據(jù)庫結(jié)果匯總將預(yù)測(cè)的蛋白序列分別與Nr、genes、string和GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp比對(duì)（BLAST2.2.28+），從而獲得預(yù)測(cè)的注釋信息。上述所有數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果的匯總信息見annotation.table.xls，詳細(xì)結(jié)果見annotation/文3-6annotation.table.xls文件各列含義說NameoftheQueryOrf序列編LengthoftheQueryOrf序列長(zhǎng)NameoftheTopHitfromNR庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序列名DescriptionabouttheTopHitfromNR庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序列描PercentageofSimilarBasesintheNR庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序列的High-ScoringSegmentPairfrom NameofTheTopHitfrom Strings庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序 DescriptionAboutTheTopHitfrom Strings庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序 PercentageofSimilarBasesInTheHigh-ScoringSegmentPairfrom

Strings庫中比對(duì)到的top目標(biāo)序 ClustersofOrthologousGroupsof EukaryoticOrthologous KO號(hào)或 NameoftheKEGG COGCOG是ClustersofOrthologousGroupsofproteins的縮寫( nih./COG/)。COG是在對(duì)已完成組的物種的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相互比較的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，COG數(shù)據(jù)庫選取的物種包括各個(gè)主要的系統(tǒng)進(jìn)化譜系。每個(gè)COG至少由來自3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化譜系的物種的蛋白所組成，所以一個(gè)COG對(duì)應(yīng)于一個(gè)古老注釋結(jié)果對(duì)蛋白進(jìn)行功能歸類，結(jié)果詳見COGannotation/COG_KOG/，本項(xiàng)目所用string數(shù)據(jù)庫的版本為 對(duì)樣品的組蛋白進(jìn)行COG功能歸類后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下圖所示3-3COG功能分類統(tǒng)計(jì)例KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，和組百科全書， KEGG將從NCBI等數(shù)據(jù)庫中獲得的包括完整和部分的組序列及其序列于KEGGgenes數(shù)據(jù)庫胞周期以及疾病相關(guān)通路等。此外，KEGGLIGAND數(shù)據(jù)庫中也收集了各種化學(xué)分子、酶以及酶促反應(yīng)等相關(guān)信在物體內(nèi)，產(chǎn)物不是孤存在而自發(fā)揮作的，同物之間通有序的互協(xié)調(diào)一起行KEGG數(shù)據(jù)庫中豐富的通路信息將有助于我們從系統(tǒng)水平去了解的生物學(xué)功能，例如代謝途徑、遺傳信息傳遞以及細(xì)胞學(xué)過程等一些復(fù)雜的生物過程。運(yùn)用BLAST算法（blastx/blastp2.2.28+）將所獲得的預(yù)測(cè)與KEGG的數(shù)據(jù)庫(Genes)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)得到的KO編號(hào)可以獲得相應(yīng)參與的具體生物學(xué)通路。KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果詳見3-5KEGG通路數(shù)據(jù)庫注：長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)表示產(chǎn)物（如酶或一些RNA調(diào)節(jié)子），所有藍(lán)色背景的產(chǎn)物都屬于KEGGORTHOLOGY（KO）分GO是本體論GeneOntology的縮寫（見： 要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力去分析生物學(xué)術(shù)語之間的聯(lián)系，而GeneOntology項(xiàng)目的目的就是為了標(biāo)準(zhǔn)化這些生物學(xué)術(shù)語，方便生物學(xué)家之間的相互交流。GO注釋包括3個(gè)方面的內(nèi)容：Cellularcomponent：thepartsofacelloritsextracellularMolecularfunction：theelementalactivitiesofageneproductatthemolecularlevel,suchasbindingorBiologicalprocess：operationsorsetsofmoleculareventswithadefinedbeginningandend,pertinenttothefunctioningofintegratedlivingunits:cells,tissues,organs,andorganisms.因此，GO注釋更加便于我們理解背后所代表的生物學(xué)意義。通過blast2go軟件對(duì)blast結(jié)果進(jìn)行了注釋分析，詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)圖表見附件 ，下圖為GO統(tǒng)計(jì)圖例3-5GO功能注釋統(tǒng)計(jì)分布例||||--orf對(duì)應(yīng)GO號(hào)四 附 ||-- ||-- ||--*.scaf ||-- scaffold序列contig ||--* rRNA預(yù)測(cè)結(jié)果gff格式文件||--*rRNA ||-- ||-- ||-- Glimmer預(yù)測(cè)結(jié)果list文件，包含每一個(gè)orf在序列上的起始、終止位置||--* ||--* 其中每一個(gè)orf的序列頭都包含以下信息：orf編號(hào)、所在的contig ||-- 與||-- 與nr庫blastp比對(duì)結(jié)|||--*.nr.blastxlsx 根據(jù)預(yù)測(cè)的原始比對(duì)結(jié)果挑選出來的xlsx注釋文件，每個(gè)orf匹配上多個(gè)||-- |||--cog.list orf對(duì)應(yīng)COG|KOG|NOG號(hào)|||--cog.sumary |||-- orf比對(duì)到strings庫中某COG、KOGNOG的具體信息|||-- |||-- ||-- |||-- 每個(gè)比對(duì)到的KO編號(hào)、KO名字以及數(shù)據(jù)庫|||--kegg_table 每個(gè)比對(duì)到的KO編號(hào)和注釋到的通路|||--pathway_table |||--pathways/*html和 ||-- ||||orf比對(duì)GO庫中某個(gè)GO的具體功能信息||所有提供的文件均為L(zhǎng)inux系統(tǒng)下的文件，壓縮包使用“tar-zcv