質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳課件

質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳小組成員：楊松，祁平新，譚華發(fā)，禮實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳檢測DNA的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在瓊脂糖中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。在pH值為8.0～8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。瓊脂糖凝膠天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin）:含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。瓊脂瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)(1)操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外監(jiān)測及定量分析。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大?。簩?shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。上樣緩沖液

0.25％溴酚蘭；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液作用：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)②在電泳中形成肉眼可見的指

示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置③使樣品呈色，使加樣操作更方便電泳指示劑：

核酸電泳常用的指示劑有兩種溴酚藍(lán)（

bromophenolblue,Bb）；

二甲苯青（

xylenecyanol,Xc），它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15minEB染料有許多優(yōu)點(diǎn)，如染色操作簡便、快速，靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出。注意：EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)盡量小心，配置和使用EB時(shí)都應(yīng)帶上手套，且注意不要把EB灑到桌面或地板上。銀染色銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收實(shí)驗(yàn)操作2.配制1%瓊脂糖凝膠及倒膠具體步驟：三角瓶內(nèi)：1g瓊脂糖+100ml(1×TBE)煮膠溶解冷卻至60℃(不燙手)加EB倒板室溫下充分凝固垂直向上拔出梳子將膠板放入電泳槽向電泳槽中加入1xTBE緩沖液至剛沒過凝膠表面。3.加樣將DNA樣品（5ul）與6×上樣緩沖液（1ul）混勻后，用微量加樣槍小心加入樣品孔內(nèi)。注意加樣槍的槍頭不可插入過深，以免刺穿凝膠，導(dǎo)致樣品外溢。每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止EB污染。

4.電泳接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為5V/cm（長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳注意事項(xiàng)1、倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會(huì)使制板變形；2、膠一定要凝固好才能拔梳