食品發(fā)酵工程 10酶制劑

PAGEPAGE1第十章酶制劑工業(yè)1.前言1.1工業(yè)酶制劑的來源及特點來源：動物：豬胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、麥芽淀粉水解酶微生物：酶的主要來源。工業(yè)生產(chǎn)的酶制劑80％是由微生物來制造的，原因是：①微生物繁殖速度快。20－30min一代，為農(nóng)作物的500倍，家畜的1000倍；②微生物種類繁多，品種全。可以產(chǎn)生適應不同環(huán)境的酶，如高溫酶、低溫酶、耐酸、耐堿等；③微生物培養(yǎng)方法簡單。原料簡單，易于大批量生產(chǎn)80%的工業(yè)酶是水解酶，用于降解Protein、strach、lipid。淀粉酶（烘焙、釀造、淀粉糖化、紡織業(yè)）、蛋白酶（去污劑、奶制品業(yè)、皮革業(yè)）和脂肪酶（去污劑、食品、精細化工）是目前工業(yè)應用的三大主要酶制劑。1.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)歷史⑴1920s，法國人Biodin和Effront在德國建廠生產(chǎn)枯草桿菌淀粉酶來代替麥芽淀粉酶，用于棉布腿漿，為微生物酶制劑工業(yè)奠定了基礎。⑵1940s，液體深層發(fā)酵技術用于淀粉酶的生產(chǎn)，酶制劑工業(yè)跨進了工業(yè)化生產(chǎn)的時代。⑶1950s，糖化酶成功用于葡萄糖生產(chǎn)，革除了沿用上百年的酸水解工藝。⑷1960s，加酶洗滌劑流行，進一步促進了酶制劑工業(yè)的發(fā)展。⑸1970s，固定化葡萄糖異構酶用于生產(chǎn)果葡糖漿，大大推動了食品工業(yè)與酶制劑工業(yè)的發(fā)展。⑹1971年，在美國召開第一屆國際酶工程會議，把大規(guī)模生產(chǎn)、分離純化、固定化技術、酶蛋白的改造和修飾、酶反應器設計、酶的工業(yè)化應用都納入酶工程范圍。★按細胞分類：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶動物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶★發(fā)酵生產(chǎn)酶的細胞必需具備的條件：①酶的產(chǎn)量高；②產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；③容易培養(yǎng)和管理；發(fā)酵周期短，營養(yǎng)需求簡單；④產(chǎn)物雜質(zhì)少，利于酶的分離純化；⑤安全可靠，非致病性。★動植物細胞培養(yǎng)缺點：①動植物細胞體積大、對剪切力敏感，要求特殊生物反應器。

動物細胞培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)，依附培養(yǎng)，固定化細胞培養(yǎng)。

植物細胞培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)，搖瓶，通用式發(fā)酵罐，氣升式、鼓泡式、旋轉圓筒式。②動植物細胞生長速率、代謝速率低，發(fā)酵周期長，對防止雜菌污染的技術要求高。③動物細胞營養(yǎng)要求苛刻?！锍Ｒ娒赴l(fā)酵生產(chǎn)用微生物:Bacillussubtilis：-淀粉酶，中性蛋白酶Esherichiacoli（胞內(nèi)酶）：－半乳糖苷酶，谷氨酸脫羧酶，天門冬酸酶，芐青霉素酰化酶，限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶，DNA連接酶，核酸外切酶Aspergillusniger：糖化酶，果膠酶，纖維素酶，半纖維素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶，Aspergillusoryzae：淀粉酶，中性蛋白酶，果膠酶，氨基?；?、脂肪酶，磷酸二酯酶Rhizopus：糖化酶，轉化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纖維素酶Mucor：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶Penicillium（產(chǎn)黃青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉素?；福z酶，纖維素酶，桔青霉，5‘－磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝乳蛋白酶，Trichoderma：纖維素酶，17-羥化酶Streptomyces：葡萄糖異構酶，中性蛋白酶，幾丁質(zhì)酶Saccharomycescerevisiae：轉化酶Candida：脂肪酶，轉化酶，尿酶，乳糖酶脆壁酵母：乳糖酶2酶的發(fā)酵生產(chǎn)在應用微生物中，所有對微生物或其它生物細胞的培養(yǎng)（動物、植物細胞）的培養(yǎng)，通稱為發(fā)酵。在現(xiàn)代工業(yè)中，酶的大量生產(chǎn)主要靠細胞發(fā)酵的方法生產(chǎn)。按細胞分類：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶、動物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶按細胞培養(yǎng)方式的不同分類：固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵2.1淀粉酶類的生產(chǎn)淀粉酶是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并且至今為止應用最廣、產(chǎn)量最大的一類酶制劑，幾乎占整個酶制劑總產(chǎn)量的50％以上。主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶。2.1.1α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)2.1.1.1菌種主要為細菌和霉菌。芽孢桿菌所產(chǎn)α-淀粉酶分為液化型和糖化型，但只有液化型有用?？莶輻U菌所產(chǎn)淀粉酶為大多數(shù)工廠采用，如液化酶BF-7689（我國淀粉糖工業(yè)使用），Tenase（美國）。地衣芽孢桿菌的酶耐熱型比枯草桿菌的高，但產(chǎn)量較低，芽孢桿菌易于退化和遭受噬菌體感染而降低產(chǎn)酶能力。由于不斷的選育改良，現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)上用的菌種產(chǎn)生α-淀粉酶的能力已是原始菌株的數(shù)倍乃至數(shù)十倍。所采用的方法有：用誘變劑進行誘變；基因工程菌等等。如將α-淀粉酶活性高而耐熱性差的枯草桿菌納豆株的DNA轉入耐熱性強而酶活性低的枯草桿菌Marburg株中，結果引起了后者遺傳性狀的改變。2.1.1.2生產(chǎn)過程霉菌的α-淀粉酶大多采用固體曲法生產(chǎn)；細菌α-淀粉酶則以液體深層發(fā)酵為主。固體培養(yǎng)：以麩皮為主要原料，添加米糠或豆餅的堿水浸出液，以補充氮源。在相對濕度90％以上，芽孢桿菌用37℃，曲霉用32－35℃培養(yǎng)36－48h后，立即在液體培養(yǎng)：以麩皮、玉米粉、米糠、玉米漿等為原料，并適當補充硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機氮源，此外還需添加少量鎂鹽、磷酸鹽、鈣鹽等。固形物濃度一般為5－6％。以霉菌為生產(chǎn)菌時，宜采用微酸性，而細菌宜在中性至微堿性培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，調(diào)pH到6左右，加入40％左右的硫酸銨靜置沉淀，傾去大部分上清夜后，加入硅藻土為助濾劑，收集沉淀于40℃下風干，為了加速干燥，減少失活，酶泥中可拌入大量硫酸鈉，磨粉后加入淀粉、乳糖、CaCl2酶的提?。何⑸锏摩?淀粉酶大部分分泌到細胞外。麩曲中的α-淀粉酶可用水或1％的食鹽水浸出（固液比1:3-4）。工業(yè)上濃縮回收α-淀粉酶常用鹽析、有機溶劑沉淀和淀粉吸附三種方法?？莶輻U菌BF-7689是我國產(chǎn)量最大、用途最廣的一種液化型淀粉酶，其最適pH6.5左右，pH低于6或高于10酶活顯著降低，最適溫度65℃作用，60℃以下穩(wěn)定。在淀粉漿中酶的最適溫度80-85℃，902.1.1.3耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)普通的細菌α-淀粉酶在水解谷物淀粉時，由于液化溫度只能在80-90℃，經(jīng)常殘留聚合度為30－40的不溶性淀粉，妨礙了過濾并以下下一步糖化的DE值。為此，在液化時須添加許多的鈣離子以提高酶的耐熱性，產(chǎn)品中含有大量的無機鹽。耐熱性從α-淀粉酶適合于高溫（105-110耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌幾乎都是地衣芽孢桿菌及其突變株，主要原因是該菌耐熱性好和產(chǎn)酶活力高，因此適合于工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外生產(chǎn)廠家有無錫酶制劑廠、丹麥NOVO公司（產(chǎn)品Thermamy）、美國Mils公司（產(chǎn)品Takahern）、荷蘭Gist公司（產(chǎn)品Maaxamyl）。2.1.2β-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)β-淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥、甘薯、豆類和一些蔬菜中。商品β-淀粉酶主要是從植物大豆、麥芽和甘薯中提取，細菌β-淀粉酶的生產(chǎn)還不多，主要的菌種有芽孢桿菌屬的多黏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等。紫皮甘薯中β-淀粉酶活性最高，將甘薯磨漿提取淀粉后的新鮮廢水（pH5.5-6.0），用醋酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH4.5-3.7以后，可將80％的β-淀粉酶沉淀析出。麩皮中的β-淀粉酶活力和大麥芽相當，且不含α-淀粉酶，故可不必精制，而用在麥芽糖漿的生產(chǎn)。2.1.3葡萄糖淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶只存在于微生物界，許多霉菌都可以生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶。工業(yè)生產(chǎn)用的菌種是根霉、黑曲霉以及擬內(nèi)孢霉等真菌，其中黑曲霉是最重要的生產(chǎn)菌種。葡萄糖淀粉酶是胞外酶，可以從培養(yǎng)液中提取處理。它是唯一用150m3根霉型葡萄糖淀粉酶：對淀粉的水解率為100％；黑曲霉型葡萄糖淀粉酶：對淀粉的水解率為80％。兩種酶的區(qū)別在于對磷酸鍵的水解力不同。工業(yè)化生產(chǎn)：⑴最初采用根霉的固體培養(yǎng)。菌種為河內(nèi)根霉，以麩皮為碳源，添加硫酸銨。⑵黑曲霉的液體深層培養(yǎng)。1978年，中科院微生物所以從土壤中分離出的As.niger202作為出發(fā)菌株，經(jīng)反復誘變得到UV-11高產(chǎn)糖化菌株。培養(yǎng)基：玉米粉12％，黃豆餅粉4％，麩皮1％，以100u/g淀粉加α-淀粉酶，pH調(diào)至4.5以下。通風培養(yǎng)90－110h。2.1.4異淀粉酶（脫支酶）異淀粉酶可以分解支鏈淀粉中的α-1,6-葡萄糖苷鍵，生成直鏈淀粉，碘反應由紅變藍。菌種：產(chǎn)氣氣桿菌ATCC9621，或產(chǎn)氣氣桿菌10016培養(yǎng)基：碳源：可溶性淀粉或薯干淀粉；氮源：豆餅粉、蛋白胨、酵母粉等。2.3蛋白酶目前全國蛋白酶的總產(chǎn)量約達2萬噸，其中堿性蛋白酶占80％。2.3.1動植物來源蛋白酶動物來源：胰蛋白酶、胃蛋白酶（酸性蛋白酶）等植物來源：木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等直接進行提取2.3.2微生物來源2.3.2.1酸性蛋白酶最適pH2.5-5.0，酸性蛋白酶中酸性氨基酸含量高，大多數(shù)在其活性中心含有2個Asp。菌種：黑曲霉、黑曲霉大孢子變種、根霉等，細菌極少培養(yǎng)基：豆餅粉、玉米粉、魚粉等，除需要高濃度的有機氮外，還需添加1－3％的無機氮。蛋白胨對黑曲霉生產(chǎn)酸性蛋白酶有很強的誘導作用。2.3.2.2中性蛋白酶這是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶。最適pH7-8，大多數(shù)微生物中性蛋白酶是金屬酶，一部分酶蛋白總含有一原子鋅。菌種：枯草桿菌S114、1.398、172，棲土曲霉3.942，放線菌166，耐熱解蛋白芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、米曲霉。培養(yǎng)基：以葡萄糖、淀粉、飴糖、玉米粉、米糠、麩皮等為碳源，以豆餅粉、魚粉、血粉、酵母等為氮源。固體培養(yǎng)或液體深層發(fā)酵。2.3.2.3堿性蛋白酶最適pH9.5-10.5，又稱絲氨酸蛋白酶，廣泛存在于細菌、放線菌和真菌中，研究最為廣泛和深入的是芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶。菌種：枯草桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和短小芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌等少數(shù)幾種。培養(yǎng)基：和中性蛋白酶類似。供洗滌劑添加的主要有卡斯柏格堿性蛋白酶。2.4纖維素酶纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一類酶的總稱。國內(nèi)外對纖維素酶有40多年的廣泛研究，目前的研究表明，纖維素酶可分成兩大類：堿性纖維素酶和酸性纖維素酶。我國纖維素酶未能工業(yè)化的主要困難：纖維素酶活力低，生產(chǎn)周期長，成本高，原材料分散，天然纖維材料難以被直接分解。纖維素酶的研究和應用需主要解決兩個問題：一個是提高酶的活力，另一個是改變天然纖維素結構，提高它對酶作用的敏感性。酸性纖維素酶的產(chǎn)生菌種主要為細菌和絲狀真菌，如綠色木霉（Trichodermaviride）、康氏木霉（Trichodermakonigii）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearthermophius）等。其中代表性的菌株有木霉、黑曲霉、變異青霉等，國內(nèi)外對木霉纖維素酶的研究較多，但木霉一方面毒性嫌疑大，其應用受到限制；另一方面普遍存在著β-葡萄糖苷鍵活性低的缺陷，致使纖維二糖的積累，酶解效率下降。近年來，用黑曲霉作生產(chǎn)菌種收到了較好的效果。堿性纖維素酶的研究比較晚，但發(fā)展很快。1980年NOVO公司發(fā)現(xiàn)了在堿性范圍有較高活性的腐植菌，通過液體發(fā)酵，成功地生產(chǎn)了洗滌劑用堿性纖維素酶，并很快得到應用。2.5脂肪酶目前生產(chǎn)上用的菌種是小