細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)

第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)邵麗軍1第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)表型分型技術(shù)基因分型技術(shù)色譜與質(zhì)譜技術(shù)細(xì)菌自動化鑒定技術(shù)血清學(xué)分型、生物化學(xué)分型、噬菌體分型、細(xì)菌素分型、耐藥譜分型等質(zhì)粒圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、核糖體分析、染色體酶切物脈沖場凝膠電泳分型、序列分型、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)等。細(xì)菌分型

氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳技術(shù)、飛行質(zhì)譜技術(shù)等。自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)。2第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)細(xì)菌噬菌體分型技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌素分型技術(shù)第三節(jié)細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)與分型第四節(jié)分子生物學(xué)分型技術(shù)第五節(jié)色譜和質(zhì)譜技術(shù)在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用第六節(jié)細(xì)菌的自動化鑒定技術(shù)3第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌噬菌體分型技術(shù)一、概述二、細(xì)菌噬菌體分型的一般原則三、噬菌體的分離、純化與增殖技術(shù)四、細(xì)菌的噬菌體分型技術(shù)五、噬菌體分型優(yōu)缺點(diǎn)（自學(xué)）4第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)噬菌體(bacteriophage;phage)是一類能感染細(xì)菌、放線菌、真菌、螺旋體等微生物的病毒，屬于專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物。自然界分布廣泛，凡有細(xì)菌的場所，均可能存在相應(yīng)的噬菌體。一、概述5第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)噬菌體的基本形態(tài)蝌蚪形微球形（無尾）細(xì)桿形（無頭）噬菌體6第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)根據(jù)與宿主菌的關(guān)系分類毒性噬菌體(virulentphage):溫和噬菌體(temperatephage):7第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)8第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)液體培養(yǎng)基中固體培養(yǎng)基上噬菌體在細(xì)菌鑒定與分型方面的應(yīng)用噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)澄清噬斑噬菌體的作用具有種特異性，一種噬菌體只能裂解一種或與該種相近的細(xì)菌；噬菌斑的形態(tài)、大小和透亮度的不同，可用于鑒定細(xì)菌的型別。

9第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)(1)細(xì)菌型別與分型噬菌體裂解特異性穩(wěn)定，分型結(jié)果重復(fù)性好。(2)噬菌體具有較高分型效率，能夠區(qū)分菌株間的細(xì)微差別，能滿足流行病學(xué)研究的需要。(3)操作方法簡便易行，實(shí)驗(yàn)耗時短，結(jié)果記錄簡明。(4)方法應(yīng)能標(biāo)準(zhǔn)化，以利結(jié)果的比較。(5)所用噬菌體應(yīng)易于獲得較高效價，能較長時間保存，噬斑清晰、大小適中，使之便于觀察和準(zhǔn)確記錄。二、細(xì)菌噬菌體分型的一般原則10第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（一）噬菌體分離三、噬菌體的分離、純化與增殖技術(shù)制備菌懸液噬菌體富集培養(yǎng)制備裂解液噬菌體確證試驗(yàn)接種適量樣品，12-24h離心，上清過濾除菌，濾液無菌試驗(yàn)平板均勻涂布一層菌液，干燥后，表層布5-7點(diǎn)，滴加濾液，一點(diǎn)生理鹽水，培養(yǎng)觀察噬斑11第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（二）噬菌體純化稀釋裂解液制備噬菌體與敏感菌混合管培養(yǎng)純化10-1至10-55個稀釋度的噬菌體各0.1ml+0.2ml對數(shù)菌液，5min選取噬斑較分散的平板，挑取典型噬斑，接種至含菌體培養(yǎng)液中過夜增殖噬菌體。分離純化單斑3次，至平板噬斑形態(tài)大小一致制備底層瓊脂平板制備上層瓊脂平板各稀釋度混合管+3ml半固體培養(yǎng)基，均勻覆蓋平板表層12第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（三）噬菌體的增殖、保存1、噬菌體增殖2、去除菌體3、噬菌體的保存液體增殖法：定時加入對數(shù)期菌體固體增殖法：同時加大菌體和噬菌體的濃度細(xì)菌濾器法和三氯甲烷法冷藏保存：無需防腐劑，分裝后7d，不宜超過4w冷凍干燥：2年13第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（四）噬菌體的效價和裂解譜的測定1、噬菌體效價的測定噬菌體效價：是指1ml液體中所含的活噬菌體的數(shù)量。用噬斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）表示。單位：PFU/ml;測定方法：雙層瓊脂平板法14第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)2、常規(guī)試驗(yàn)稀釋度測定噬菌體的常規(guī)試驗(yàn)稀釋度(routinetestdilution,RTD)：是將噬菌體進(jìn)行10倍系列稀釋，各稀釋度噬菌體溶液點(diǎn)在宿主菌涂布的斑點(diǎn)上，經(jīng)培養(yǎng)后，能產(chǎn)生僅次于融合性裂解（CL）的最高稀釋度。RTD測定意義：高濃度噬菌體會對宿主菌產(chǎn)生裂解外觀，為避免噬菌體對細(xì)菌這種非特異性破壞，使分型噬菌體顯示最高的特異性，將噬菌體間的交叉反應(yīng)降到最低，建議使用RTD或稱為臨界試驗(yàn)稀釋。RTD與PFU關(guān)系，均是噬菌體效價的計量單位。受噬斑大小的影響，一般的RTD約含1X106pfu/ml15第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)3、裂解譜裂解譜是指一種噬菌體的作用范圍。即確定該噬菌體在種內(nèi)或?qū)賰?nèi)的廣譜性，在種外或?qū)偻獾慕徊娣磻?yīng)性。裂解模式是指各種細(xì)菌培養(yǎng)物被幾種噬菌體作用而出現(xiàn)的特殊的反應(yīng)模式，不同的細(xì)菌，可呈現(xiàn)不同的反應(yīng)模式。裂解譜和裂解模式一般用噬菌體原液進(jìn)行試驗(yàn)，效價在103～105RTD或109～1011PFU/ml之間。分型試驗(yàn)一般用1RTD的噬菌體。16第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)制備菌懸液菌液涂布平板選點(diǎn)滴加不同噬菌體不能混有雜菌直接涂布或雙層瓊脂平板斑點(diǎn)滴定的結(jié)果記錄如下:融合性溶解程度:融合性溶解(CL)、次融合性溶解(＜CL)、半融合性溶解(SCL)、次半融合性溶解(＜SCL)、融合性不透明溶解，中心混濁，菌苔厚(OL)。單個噬斑:大(L)即＞1.5mm、正常(N)約1.0mm、小(S)0.1~1.0mm、細(xì)小(m)＜

0.1mm、微小(μ)。細(xì)小和微小均僅能用放大鏡觀察。噬斑的數(shù)量:0~5(-)、6~20(±)、1~40(+)、41~60(++)、61~120(+++)、>120(++++)。四、細(xì)菌噬菌體分型技術(shù)17第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌素分型技術(shù)細(xì)菌素(bacteriocin)是某些細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)，這種物質(zhì)僅對與產(chǎn)生菌親緣關(guān)系近的細(xì)菌有抗菌作用，而對產(chǎn)生菌本身不敏感。如大腸菌素、綠膿菌素、蠟樣芽胞桿菌素等?？股乜咕厥羌?xì)菌、真菌等微生物在生長過程中為了生存競爭需要而產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì),這種物質(zhì)可保證其自身生存,同時還可殺滅或抑制其它微生物。細(xì)菌產(chǎn)生的有多粘菌素、抗菌肽等。一、概述18第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)細(xì)菌素特點(diǎn)抗菌范圍很窄，在治療上應(yīng)用價值不大，但可進(jìn)行細(xì)菌分型和流行病學(xué)調(diào)查。細(xì)菌素分型方法利用不同型別的細(xì)菌素產(chǎn)生菌測定試驗(yàn)菌的細(xì)菌素敏感模式（檢測未知菌）利用已知對不同型別細(xì)菌素敏感的菌株作為指示菌，測定試驗(yàn)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的模式19第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（一）待測菌對細(xì)菌素敏感模式分型試驗(yàn)方法（綠膿菌素為例）綠膿菌素制備綠膿菌素敏感試驗(yàn)細(xì)菌素分型試驗(yàn)有清晰抑菌圈，圈內(nèi)無菌落者為完全抑菌;抑菌圈中尚有部分菌落為不完全抑菌;無抑菌圈表示該菌對此種綠膿菌素不敏感。二、細(xì)菌素分型方法待測菌鋪滿平板，干燥后加細(xì)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，觀察抑菌圈。20第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（二）平板交叉劃線分型法適用于細(xì)菌素產(chǎn)生量不多的細(xì)菌已知細(xì)菌素產(chǎn)生菌劃線接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h無菌水沖洗掉菌苔，放置2cm*2cm濾紙片，滴加三氯甲烷，滅菌多種待測菌株與原產(chǎn)細(xì)菌素菌株成垂直交叉劃線接種，培養(yǎng)24-48h，觀察交叉點(diǎn)上是否有菌生長，判定待測菌菌型。21第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（三）待檢菌產(chǎn)生細(xì)菌素對指示菌敏感模式分型方法方法同平板交叉劃線分型法已知細(xì)菌素產(chǎn)生菌劃線接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h無菌水沖洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸滅菌多種細(xì)菌素敏感的指示菌依次垂直交叉劃線接種，培養(yǎng)24-48h，觀察交叉點(diǎn)菌生長情況，判定產(chǎn)生細(xì)菌素試驗(yàn)菌菌型。22第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)一、概述二、紙片擴(kuò)散法三、稀釋法四、結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)與分型23第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)(drugsusceptibilitytest)是指在體外測定抗菌藥物抑制或殺死細(xì)菌能力的試驗(yàn)，簡稱藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)方法紙片擴(kuò)散法、稀釋法、抗生素濃度梯度法（E-試驗(yàn)法）、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)、自動化檢測法、分子生物學(xué)方法等。一、概述24第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（一）基本原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢菌的生長被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映檢測菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。二、紙片擴(kuò)散法（K-B法）25第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)(二)培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1．抗菌藥物紙片：商品化，選擇直徑為6.35mm，吸水量為20μl的專用藥敏紙片，用逐片加樣或浸泡方法使每片含藥量達(dá)規(guī)定要求。含藥紙片密封貯存于超低溫冰箱。2．培養(yǎng)基：水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，4℃保存。26第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)1.在瓊脂平板上挑取形態(tài)相同的菌落4～5個，接種于3～5mLM-H肉湯中，36℃培養(yǎng)4～8h，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比較，可用肉湯或生理鹽水稀釋至與0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相同2.在15min內(nèi)，用無菌棉簽蘸取菌液，并在管壁上擠去多余的菌液后涂布于M-H瓊脂平板上（注意：涂布要均勻、致密），待干3.鑷子滅菌冷卻后，夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，即兩紙片間距不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm。36℃溫箱培養(yǎng)16～18h觀察結(jié)果。（三）試驗(yàn)步驟27第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)28第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（四）結(jié)果判斷和報告

用精確度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，作出“敏感”、“耐藥”或“中介”的判斷。幾種抗生素抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)的最低抑菌濃度≤4≥8≥1513～14≤1210IU慶大霉素GEN≤0.5≥8≥2314～22≤1315IU紅霉素ERY≤0.1≥2921～28≤2010IU青霉素GP-G敏感耐藥敏感中介耐藥相應(yīng)的MIC（μg/ml）抑菌環(huán)直徑（mm）紙片含藥量抗生素代號29第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)“敏感”（sensitive，S）：表示測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制；“耐藥”（resistant，R）：表示測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效?！爸薪椤保╥ntermediate，I）：表示測試菌對常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效。30第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)（五）質(zhì)量控制采用質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株和測試菌在同一條件下做藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株的抑菌圈在允許范圍內(nèi)，結(jié)果可信。目的：檢查試驗(yàn)條件（如培養(yǎng)基、含藥紙片和接種菌量）、操作技術(shù)等是否合格質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC25923等31第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)稀釋法是體外定量測定抗菌藥物抑制細(xì)菌生長活性的方法，所獲結(jié)果比較準(zhǔn)確，常被用作校正其他方法的標(biāo)準(zhǔn)。原理是用一系列不同濃度的藥物與等量細(xì)菌作用，找出能抑制細(xì)菌生長的最低濃度或殺滅細(xì)菌的最低濃度，其結(jié)果用最小抑菌濃度(MIC)

或最小殺菌濃度(MBC)表示P101。分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。三、稀釋法32第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)肉湯稀釋法123456789101133第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)123456789101134第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)123456789101135第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)特殊性：結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，在細(xì)菌生長之前藥物已擴(kuò)散而無法影響細(xì)菌的生長。方法：絕對濃度法、比例法、放射測量法等。絕對濃度法:是我國實(shí)驗(yàn)室普遍使用方法。將濃度遞減的藥物與等量培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基，不含藥培養(yǎng)基為對照，分別接種待測菌和標(biāo)準(zhǔn)菌，培養(yǎng)4w，菌落數(shù)多于20個為陽性（據(jù)此判定MIC）。受試菌與標(biāo)準(zhǔn)菌MIC的菌落數(shù)比值≤2判為敏感，≥8為耐藥。比例法：WHO、國際防癆和肺病聯(lián)合會推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。將不同稀釋度的待測菌接種于相同濃度的含藥培養(yǎng)基，檢測耐藥性。四、結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)36第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)一、核糖體分型二、脈沖場凝膠電泳分型三、序列分型四、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)第四節(jié)分子生物學(xué)分型技術(shù)37第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)實(shí)質(zhì)：核酸探針雜交分型技術(shù)。核糖體RNA（rRNA）基因最為保守，在基因組上存在多個拷貝，以rRNA基因片段為探針，檢出含有rRNA基因的DNA片段，通過分型雜交后的rRNA指紋圖，進(jìn)行菌種分型和近源菌株的鑒定。原理：樣本DNA經(jīng)酶切消化，凝膠電泳分離片段，轉(zhuǎn)印到膜上進(jìn)行Southern印跡雜交分析。以rRNA基因片段為探針，雜交產(chǎn)生菌株特異性的DNA指紋圖，與平行樣本或數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對達(dá)到分型目的。一、核糖體分型38第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)39第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)實(shí)驗(yàn)過程探針的設(shè)計：一般以16SrRNA和23SrRNA作為探針，現(xiàn)已商品化菌體的分離培養(yǎng)與DNA提取菌體DNA酶切及電泳Southern印跡雜交全自動微生物核糖體基因分型系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)是高效簡便、快速、以標(biāo)準(zhǔn)化；缺點(diǎn)是費(fèi)用高。40第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)是細(xì)菌分型較靈敏的方法，通過檢測染色體上所有酶切位點(diǎn)的變化，反映全部基因的相關(guān)性，提供可靠的基因分型依據(jù)。優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)，是基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在識別和追蹤醫(yī)院感染暴發(fā)和流行上具有實(shí)用價值。與普通凝膠電泳區(qū)別：普通電泳分離DNA分子的上限是50Kb，而PFGE能分離10-800kb的DNA片段。二、脈沖場凝膠電泳分型41第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)PFGE分型原理是將細(xì)菌包埋于凝膠塊中，用溶菌酶和蛋白酶K消化菌體和蛋白質(zhì)，釋放完整的染色體DNA，采用稀有切點(diǎn)酶酶切DNA，產(chǎn)生有限數(shù)目的高分子量限制性片段。在特定的電泳系統(tǒng)中，定時改變電場方向，反復(fù)循環(huán)，使DNA在凝膠網(wǎng)孔中呈曲線泳動而得到分離，形成特定的電泳條帶圖譜。不同菌株的電泳圖譜具有高度特異性，染色后目測形成的片段條帶，而識別特異的菌株。42第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)43第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)操作步驟細(xì)菌菌株的培養(yǎng)結(jié)果處理凝膠塊制備菌體裂解膠塊洗滌脈沖式電泳酶切44第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)45第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)46第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)原理：通對待測菌的全基因序列進(jìn)行分析，與GENEBANK中的已知序列進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)分型。方法：Sanger雙脫氧鏈終止法、化學(xué)修飾法、自動測序技術(shù)三、序列分型47第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)定義：是高通量測序技術(shù)和群體遺傳學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，通過測序技術(shù)揭示保守基因的等位基因突變，實(shí)現(xiàn)對病原菌的分型與鑒定。特點(diǎn)：簡便易行，重復(fù)性好，且可通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)共享和比較。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）48第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)原理49第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)分析方法50第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)步驟51第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)MLST和PFGE分型技術(shù)比較52第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)色譜法或稱層析法是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法，是多組分混合物分離分析的最重要分析方法。在所有色譜體系中都包含兩大部分，即流動相和固定相，以液體為流動相者稱為液相色譜(LC)

，以氣體為流動相者稱為氣相色譜(GC)

。色譜和質(zhì)譜通過對細(xì)菌代謝組和蛋白質(zhì)組分析，進(jìn)行細(xì)菌鑒定。第五節(jié)色譜和質(zhì)譜技術(shù)在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用53第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)氣相色譜法可分為氣-液色譜(GLC)和氣-固色譜(GSC)

。前者是分配色譜，后者是吸附色譜。特點(diǎn)：高分離效能（短時間同時分離測定復(fù)雜組分混合物）高選擇性（能分離分析性能極為相似的物質(zhì)）高靈敏度（痕量分析10-11-10-13g，甚至一個細(xì)菌代謝物）高分離速度（一個分析周期幾分鐘至十幾分鐘）定量結(jié)果準(zhǔn)確易于自動化應(yīng)用范圍廣一、氣相色譜法在細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用54第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)氣相色譜法與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法區(qū)別：不需細(xì)菌分離培養(yǎng)過程，通過對細(xì)菌組成成分和分解代謝產(chǎn)物分析，鑒定細(xì)菌科、屬、種、株。鑒定時不需活菌。55第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)氣相色譜法鑒定細(xì)菌的途徑：分析細(xì)菌細(xì)胞裂解產(chǎn)物分析細(xì)菌細(xì)胞的酸性或堿性條件下的水解物分析培養(yǎng)物中的揮發(fā)性產(chǎn)物，如氣體、酸、醇分析培養(yǎng)物中的代謝產(chǎn)物分析細(xì)菌培養(yǎng)基質(zhì)降解代謝產(chǎn)物分析細(xì)菌在血清、臨床標(biāo)本或生物制品中的活力56第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)氣相色譜法在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用：分析細(xì)菌細(xì)胞成分（如分析菌體脂肪酸，鑒定菌體親緣關(guān)系）分析細(xì)菌在體外培養(yǎng)物中的代謝產(chǎn)物（如厭氧菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸色譜圖、需氧菌的有機(jī)酸色譜圖等）臨床標(biāo)本中檢出和鑒定細(xì)菌（如檢測腦脊液中的乳酸，對細(xì)菌性腦膜炎做出明確診斷等）熱裂解氣相色譜法鑒定細(xì)菌（將樣品干燥高溫裂解，碎片色譜圖鑒定微生物，如沙門菌屬十種血清型鑒別）高分辨氣相色譜法分析冷凍條件下細(xì)菌的揮發(fā)性有機(jī)產(chǎn)物（鑒定引起冷凍品腐敗的微生物）57第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)液相色譜法基于混合物中各組分對固定相和流動相親和力的差異分離組分的。二、液相色譜法在細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用58第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)59第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)分類1、按吸附力分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜和離子色譜等2、按固定相分液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜（正常相色譜法和反相液相色譜）。60第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)反相高效色譜法根據(jù)菌種間某些特征大分子的結(jié)構(gòu)、大小、電荷分布等方面存在的固有差異對菌體進(jìn)行快速鑒別（如對分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)中分枝菌酸進(jìn)行分析，根據(jù)色譜圖鑒別菌種）。變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）：近年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量篩選DNA序列變異的基因檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷、突變檢測、分型鑒別等診斷檢測中，也適合于大批量檢測環(huán)境或食品樣品中的致病微生物的靶基因。61第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)毛細(xì)管電泳(CE)，又叫高效毛細(xì)管電泳或毛細(xì)管分離法，是八十年代問世的一種高效的液相分離方法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。即以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品各組分遷移速度和分配上的差異而進(jìn)行分離。三、毛細(xì)管電泳在細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用62第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：1、采用了內(nèi)徑在25~100μm，外徑300~400μm的毛細(xì)管，使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高2、采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓，電場推動力大，使柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，1、CE技術(shù)要點(diǎn)63第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)2、CE原理

毛細(xì)管電泳中，帶電粒子的運(yùn)動受到兩種作用：電泳和電滲。電泳是指溶液中帶電粒子(離子、膠團(tuán))在電場中定向移動的現(xiàn)象，是驅(qū)動毛細(xì)管中電解質(zhì)運(yùn)動的一種作用力。電滲是在電場的作用下，毛細(xì)管中的溶液表層聚集的正電荷向負(fù)極運(yùn)動的現(xiàn)象。64第四章細(xì)菌的分型及其檢測技術(shù)3、高效毛細(xì)管電泳分離模式

毛細(xì)管區(qū)帶