化學合成分離技術(shù)

層析別離技術(shù)李旭琴2019-4-181層析法分類(1)按兩相的狀態(tài)來分：(2)按固定相的使用形式〔即實驗技術(shù)〕分：柱層析(CC)、薄層層析(TLC)、紙上層析(3)按別離機制〔即物理化學性質(zhì)〕分：吸附層析、分配層析、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾等(4)按展開方式分：洗脫法、迎頭法、置換法

流動相固定相21.1柱層析原理1.2柱層析技術(shù)1.3柱層析本卷須知目錄1.柱層析(CC)2.薄層層析(TLC)31.1柱層析原理：吸附柱層析是利用吸附劑對混合試樣各組分的吸附力不同而使各組分別離。固定相：固體吸附劑流動相：即洗脫劑

目前，我們最常用的就是以硅膠、氧化鋁兩種物質(zhì)為填充劑的色譜柱，常稱為：硅膠柱和氧化鋁柱。1.柱層析(CC)4

當采用溶劑洗脫時，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程，由于不同的化合物吸附能力也不同，吸附力較強的組分，移動的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動的距離大，先出柱。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入外表積大，經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當待別離的混合物流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。柱層析原理：5上樣洗脫裝柱1.2柱層析技術(shù)柱層析的裝柱比較重要，裝柱的效果直接影響層析別離效果。因此，是制備性別離的一種根本操作技能。6稱量：200-300目硅膠，稱10-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。攪成勻漿：參加干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/甲醇體系，就用氯仿拌。裝柱步驟7(3)裝柱：將柱底用少許脫脂棉輕輕塞緊，再蓋一層厚的石英砂，關(guān)閉活塞，向柱中參加約1/3體積石油醚〔氯仿〕，翻開柱下活塞，將勻漿(硅膠或氧化鋁與溶劑的混合物)經(jīng)漏斗一次倒入柱中，使硅膠(或氧化鋁)自然沉降。再在上面加厚的石英砂。保持一定流速，不能使液面低于石英砂上層。(4)壓實：沉降完成后，參加更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應進行這一步，可使別離度提高很多，且可以防止過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。8裝柱子〔添硅膠〕時，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱。濕法裝柱：是先把硅膠用適當?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用洗脫劑“走柱子〞，本法最大的?yōu)點是柱子裝的比較結(jié)實，沒有氣泡。裝柱方法9干法裝柱干法裝柱：將干吸附劑〔未與洗脫劑混合〕裝柱，是直接往柱子里填入硅膠，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至適宜高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝的很結(jié)實。接著是設(shè)法將樣品加到上面，從柱項參加洗脫劑，“走柱子〞。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。10優(yōu)點是：較方便，別離效率高，別離效果與制備性薄層層析相似，可以將薄層層析的別離條件直接用于干柱層析，從而別離出更多量的化學成分。缺點在于：由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱，容易產(chǎn)生氣泡，這一點在使用低沸點的洗脫劑如乙醚，二氯甲烷時最為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易覺察，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴重時，整個柱子變花，樣品不可能平整地通過，當然也就談不上別離了。解決的方法是：硅膠一定要填結(jié)實；一定要用較多的溶劑“走柱子〞，等到柱子的下端不再發(fā)熱，恢復到室溫后再撤去壓力。干法裝柱優(yōu)缺點11層析柱硅膠的用量一般是每別離1g產(chǎn)品使用30-100g硅膠柱子的形狀比例一般是內(nèi)徑:高度=1:8~10不管干法還是濕法，硅膠〔固定相〕的上外表一定要平整，并且硅膠〔固定相〕的高度一般為15cm左右，太短了可能別離效果不好，太長了也會由于擴散或拖尾導致別離效果不好。溶劑盡量使用能夠分開的極性最低的溶劑濕法裝柱時最好是先在底部裝有石英砂的柱子中預加溶劑再按濕法加料這樣能保證一開始參加的填料處于全濕狀態(tài)，杜絕氣泡剛裝的柱子在一段時間內(nèi)可能會有長度變短的現(xiàn)象所以穩(wěn)定一段時間后再使用裝柱要領(lǐng)：要做到密實均勻無氣泡。經(jīng)驗：萬一裝柱時帶入氣泡，可從上端壓入大量溶劑將氣泡從下端擠出。裝柱注意12上樣:又稱加樣或樣品上柱。也有干法和濕法之分。干法上樣就是把待別離的樣品與易揮發(fā)溶劑混合后，再與吸附劑吸收、揮干揮發(fā)性溶劑后，撒布于柱的上端。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑〔最好就是柱層析所用的洗脫劑，如果溶解度不好，那么可以用一極性較大的溶劑，但必須少量〕將樣品溶解，再小心的參加層析柱項端的平面內(nèi)。濕法較方便。加樣的根本要求是均勻薄餅樣層。上樣13洗脫洗脫：柱層析所用的溶劑，習慣上稱為洗脫劑。洗脫操作的目的當然是要將參加的樣品中各個組分先后從上往下帶出來，并能分開收集各成分。洗脫的過程中，上端溶劑不能干，分段收集是關(guān)鍵；下端燒杯定時換，薄層紙層化學檢；洗脫劑可隨意變，混合過渡為重點。1415收集的試管大小要以樣品量而定。一般采用幾個試管〔或錐形瓶〕進行收集，通過對收集的幾瓶洗脫液進行薄層分析判斷是否為需要的產(chǎn)物，合并需要的溶液，濃縮，經(jīng)過這樣的掐頭去尾就可以得到符合要求的樣品了。溶液接收及檢測161.3柱層析本卷須知：(1)先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化。(2)棉花不要塞的太緊，否那么影響洗脫速度。(3)色譜柱要填裝緊密，將柱子必須裝平整、均勻(4)樣品層要上的薄，考慮有限柱填料的吸附量(5)可考慮用梯度法分開并洗脫(6)固定相要始終浸于溶液中，防止柱身干裂。(7)色譜柱的活塞不涂凡士林。17薄層層析是在玻璃板上涂布一層支持劑，待別離樣品點在薄層板一端，然后讓推動劑從上流動，從而使各組分得到別離的物理方法。常用的支持劑有：硅膠G、硅膠GF254、氧化鋁、纖維素、硅藻土等。使用的支持劑種類不同，其別離原理也不盡相同，有分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析等多種。2.薄層層析(TLC)2.1TLC原理18先做TLC檢視成分的多少主點和次點：點樣展開顯色2.2TLC分析技術(shù)以毛細管吸取樣品點在起跑線上，少量屢次，直徑不超過2mm，點完后，以紫外燈照射以確定濃度適當。點樣：19顯色如果組分有色，可得到有色斑點，那么不需顯色；當組分無色時，需要顯色。一般有兩種顯色方法：(1)紫外光顯色法：應用鉛筆描出斑點位置。(2)顯色劑顯色法：用化學試劑作顯色劑，以顯示組分斑點的位置。20TLC分析技術(shù)影響Rf的主要因素：

(1)吸附劑

(2)溶劑體系

(3)樣品本身性質(zhì)

(4)溫度

(5)pH比移值：表示某組分移動速率的快慢，用Rf

表示。ab21別離效果和所用硅膠有關(guān)系。不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產(chǎn)品在各廠家的硅膠中別離效果有差異。鑒于此，硅膠一定要密封保存，防止吸潮。TLC所用的硅膠板一定要保存在枯燥器里面，或使用前在紅外烘箱里枯燥一段時間。溶劑的含水量和雜質(zhì)含量對別離效果都有明顯的影響。溫度對別離效果影響也很明顯。在實驗過程發(fā)現(xiàn)，在夏天別離相同的產(chǎn)品，所需的洗脫劑極性要比在冬天小很多。22展開劑體系極性小的用石油醚：乙酸乙酯體系

極性較大的用氯仿：甲醇體系

極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸體系

拖尾可以參加少量氨水或冰醋酸TLC分析技術(shù)23選擇適當?shù)恼归_劑是首要任務一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能到達很好的別離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：石油醚:乙酸乙酯，石油醚:丙酮，石油醚:乙醚，石油醚:二氯甲烷，氯仿:丙酮，二氯甲烷:甲醇，氯仿:甲醇24展開劑的比例展開劑的比例要靠嘗試，一般根據(jù)文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個別離效果好的展開劑。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來到達最正確效果。一般把兩種溶劑混合時，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開的跡象，再調(diào)整比例，到達最正確效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。25

對于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質(zhì)來中和硅膠的酸性。當然，選擇所添加的堿性物質(zhì)，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無疑是較好的選擇。展開劑262.3TLC本卷須知(1)某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。因此在尋找展開劑時，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點分不開，極性太大，也分不開。一般以目標產(chǎn)物的Rf值在左右為最正確。(2)樣品點不能點得太濃，否那么容易重疊，不易判斷，因為如果兩個點相近的話，一濃就變成一個點。(3)板上點的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較適宜了，才能有一個較好的別離效果。27TLC跟蹤反響在點板的時候往往是反響體系的混和溶液點一個點A，每種難揮發(fā)的原料各點一個點B,C,D等等，然后所有的原料和反響體系的混合溶液再共同點一個混合點X，這些點在板上的位置如下圖：28這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個點的位置，把A這個點展開后的各個層份的點與B,C等原料比較，從而判斷原料消失沒有，點混合點X的目的在于，方便觀察，因為有時候，板展開后，各點的位置有些變形，或者由于邊緣效應等等，使得判斷不易。AXBCD29TLC判斷純度

利用TLC判斷物質(zhì)的純度時，往往要和NMR相結(jié)合，因為某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。但由于1HNMR可鑒別的純度也就在95%左右，有時候1HNMR現(xiàn)示較純的東西，一點板就會發(fā)現(xiàn)有幾個點。所以，兩者要結(jié)合使用。30W.ClarkStill,MichaelKahn,andAbhijitMitra,RapidchromatographictechniqueforpreparativeseparationswithmoderateresolutionJ.Org.Che