發(fā)酵工程第章-培養(yǎng)基的制備與滅菌

發(fā)酵工程第章-培養(yǎng)基的制備與滅菌第一頁(yè)，共68頁(yè)。有機(jī)氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等無(wú)機(jī)氮：尿素、硫酸銨、氨水、硝酸鹽功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物；2.氮源

第二頁(yè)，共68頁(yè)。

磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽3.無(wú)機(jī)鹽鐵、錳、鈷等微量元素功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位；第三頁(yè)，共68頁(yè)。4.特殊生長(zhǎng)因子：硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌酸等

功能：酶的輔助部分，維持生命活動(dòng)；第四頁(yè)，共68頁(yè)。5．發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑第五頁(yè)，共68頁(yè)。1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過(guò)程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒(méi)有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。

如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。第六頁(yè)，共68頁(yè)。第七頁(yè)，共68頁(yè)。2）、促進(jìn)劑：指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。比如在酶制劑發(fā)酵過(guò)程中，加入誘導(dǎo)物、表明活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑（比如吐溫80、植酸、洗衣粉等）第八頁(yè)，共68頁(yè)。3）、抑制劑：在發(fā)酵過(guò)程中加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來(lái)。

例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過(guò)程中的乙醛生成加成物。第九頁(yè)，共68頁(yè)。6.水分功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行第十頁(yè)，共68頁(yè)。二、培養(yǎng)基的類型

1.依營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源分類天然培養(yǎng)基；合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）；半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機(jī)碳源、氮源、生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）；第十一頁(yè)，共68頁(yè)。2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)分：1）固體培養(yǎng)基A、凝固培養(yǎng)基：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無(wú)機(jī)硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如麩皮，米糠，木屑等D、濾膜：是一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o(wú)數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，把它制成圓片狀覆蓋在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。第十二頁(yè)，共68頁(yè)。2）半固體培養(yǎng)基再配置號(hào)的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效價(jià)測(cè)定等第十三頁(yè)，共68頁(yè)。3）液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中80～90%是水。第十四頁(yè)，共68頁(yè)。3.依培養(yǎng)基的用途來(lái)分1）、孢子培養(yǎng)基2）、種子培養(yǎng)基3)、發(fā)酵培養(yǎng)基4）、補(bǔ)料培養(yǎng)基5）、加富培養(yǎng)基6）、選擇培養(yǎng)基7）、鑒別培養(yǎng)基8）、增殖和保存培養(yǎng)基9）、富集培養(yǎng)基10）、測(cè)定培養(yǎng)基第十五頁(yè)，共68頁(yè)。三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

一）、配置培養(yǎng)基的原則1、根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基2、注意各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的目的配置5、盡量使用廉價(jià)易得的原料第十六頁(yè)，共68頁(yè)。1、生態(tài)模擬2、查閱文獻(xiàn)3、借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)法精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方4、實(shí)驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)的規(guī)模一般由定性到定量，由小到大。發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，配制時(shí)兼顧原料來(lái)源、成本及工藝管理；二）、配置培養(yǎng)基的方法第十七頁(yè)，共68頁(yè)。發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇程序要了解生產(chǎn)菌種的來(lái)源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營(yíng)養(yǎng)要求；對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等要有所了解

應(yīng)先以合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，先進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，再進(jìn)行小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，探索此生產(chǎn)菌種對(duì)各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力第十八頁(yè)，共68頁(yè)。要注意培養(yǎng)過(guò)程中的pH值變化，比較適于菌體生長(zhǎng)繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的pH值差異，不斷調(diào)整在初步研究的基礎(chǔ)之上，先確立一個(gè)培養(yǎng)基配比；再進(jìn)行各種重要的金屬和非金屬離子的影響試驗(yàn)，試驗(yàn)各種無(wú)機(jī)鹽的最高、最低和最合的用量在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)，探討各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。

如培養(yǎng)過(guò)程中的pH值變化與培養(yǎng)基各種組成的關(guān)系。第十九頁(yè)，共68頁(yè)。四、原料轉(zhuǎn)換及意義1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率；2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇日本1959年開始研究由醋酸發(fā)酵生成谷氨酸的工藝，并于1968年由味之素公司設(shè)廠制造，為發(fā)酵法制造谷氨酸由“糧食發(fā)酵”轉(zhuǎn)入“無(wú)糧發(fā)酵”奠定了基礎(chǔ)。谷氨酸發(fā)酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或薯粉水解糖液，產(chǎn)糖地區(qū)則采用價(jià)格低廉的糖蜜為原料第二十頁(yè)，共68頁(yè)。隨著石油化工的發(fā)展，合成醋酸和乙醇的產(chǎn)量逐年增加，醋酸和乙醇作為一種新型發(fā)酵原料，越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，國(guó)外乙醇代糧發(fā)酵的研究取得了重大進(jìn)展，除抗生素外，幾乎所有用糧食發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品，如氨基酸、有機(jī)酸、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、糖類、脂肪、維生素、核酸類物質(zhì)等，都可以用乙醇為碳源發(fā)酵生產(chǎn)。第二十一頁(yè)，共68頁(yè)。第二節(jié)淀粉水解糖的制備

一、淀粉水解糖的制備方法1、酸解法：定義：以酸（無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法.優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短（20min），設(shè)備生產(chǎn)能力大缺點(diǎn)：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對(duì)原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過(guò)大，淀粉乳濃度不能過(guò)高。第二十二頁(yè)，共68頁(yè)。2、酶解法：（雙酶水解法）

定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程。一般分為兩步：第一步是利用α－淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過(guò)程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程，稱為糖化。也稱雙酶法第二十三頁(yè)，共68頁(yè)。α-淀粉酶（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）優(yōu)點(diǎn)：1、反應(yīng)條件溫和。2、酶的專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少3、可在較高的淀粉乳濃度下水解4、糖液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富5、糖液色澤淺，無(wú)苦味，有利于糖液的精制缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)（2～3）天，要求的設(shè)備多，糖液過(guò)濾困難。第二十四頁(yè)，共68頁(yè)。3、酸酶結(jié)合法酸酶法酶酸法第二十五頁(yè)，共68頁(yè)。1)酸酶法事先將淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶將其水解為葡萄糖玉米、小麥等谷類淀粉，淀粉顆粒堅(jiān)實(shí)，如用α－淀粉酶在短時(shí)間內(nèi)液化往往不徹底。酸液化速度快，且糖化是由酶來(lái)進(jìn)行的，對(duì)液化液要求不高，可采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率。用酸量較少，產(chǎn)品顏色淺，糖液質(zhì)量高。第二十六頁(yè)，共68頁(yè)。2)酶酸法先用α－淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖有些原料（如碎米淀粉），顆粒大小不一，酸法水解不均勻，出糖率低，故采用先經(jīng)淀粉酶液化，過(guò)濾除雜質(zhì)后再酸水解能采用粗原料淀粉，淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制，時(shí)間短。而且酸水解pH稍高，可減少副產(chǎn)物的形成，糖液色澤較淺。表2-2不同糖化工藝糖化質(zhì)量比較第二十七頁(yè)，共68頁(yè)。二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ)

淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)發(fā)生著：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子間經(jīng)1-6糖苷鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復(fù)合低聚糖）。分解反應(yīng)：葡萄糖羥甲基糠醛有機(jī)酸、色素等第二十八頁(yè)，共68頁(yè)。㈠淀粉的水解反應(yīng)

1.淀粉水解過(guò)程顏色變化：藍(lán)色暗紫紫紅褐暗紅紅淺紅

水解總趨勢(shì):淀粉→糊精→低聚糖→葡萄糖;其中葡萄糖單位30-35時(shí)遇碘變藍(lán),隨著聚合度的降低,呈現(xiàn)上述顏色變化第二十九頁(yè)，共68頁(yè)。2、淀粉酸水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)屬于單分子一級(jí)反應(yīng)類型：K：反應(yīng)速度常數(shù)，由反應(yīng)條件（如溫度、酸度等）而定C：淀粉濃度濃度對(duì)時(shí)間求導(dǎo)，濃度的降低第三十頁(yè)，共68頁(yè)。3、影響酸水解的因素酸的種類主要因素濃度（酸的濃度、淀粉的濃度）水解溫度第三十一頁(yè)，共68頁(yè)。（二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過(guò)程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過(guò)糖苷鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。第三十二頁(yè)，共68頁(yè)。影響復(fù)合反應(yīng)的因素：1、淀粉濃度的影響（用DE值表示葡萄糖純度）：DE值＝還原糖/干物質(zhì)×100％2.、酸的影響：第三十三頁(yè)，共68頁(yè)。（三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素

葡萄糖5’-羥甲基糠醛乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)；影響因素：濃度、溫度、pH值；第三十四頁(yè)，共68頁(yè)。第三節(jié)糖蜜前處理

一、糖蜜的來(lái)源與特點(diǎn)糖蜜的干物質(zhì)濃度很高，約80~90Bx，含糖量在50%以上，另含5%~12%的膠體物質(zhì)和10%~12%灰分，此外產(chǎn)酸細(xì)菌多，某些糖蜜還含有較多的生物素。如不進(jìn)行預(yù)處理，則微生物難于生長(zhǎng)和發(fā)酵。近年來(lái)，由于制糖技術(shù)提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可發(fā)酵性糖減少，非發(fā)酵性糖增加，膠體物質(zhì)和灰分也顯著增加，因此，糖蜜發(fā)酵前必須進(jìn)行預(yù)處理。第三十五頁(yè)，共68頁(yè)。一、糖蜜的來(lái)源與特點(diǎn)二、糖蜜前處理的方法1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx加入0.2～0.3％濃硫酸，通入壓縮空氣1h靜置澄清8h，取上清液。第三十六頁(yè)，共68頁(yè)。2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）：糖蜜加水稀釋到40％加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到4～4.5放入澄清槽加熱至80～90℃，通風(fēng)30min保溫70～80℃8～12小時(shí)，取上清液。第三十七頁(yè)，共68頁(yè)。3、添加絮凝劑澄清處理法：糖蜜稀釋至30～40Bx加硫酸調(diào)pH3～3.8加熱至90℃添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），攪拌均勻靜置1小時(shí)，取上清液。第三十八頁(yè)，共68頁(yè)。三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜預(yù)處理

1.糖蜜預(yù)處理法活性炭處理法樹脂處理法亞硝酸處理法2.添加化學(xué)藥劑處理法添加青霉素法添加表面活性劑添加抗氧劑法3.追加糖蜜法4.營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株法第三十九頁(yè)，共68頁(yè)。第四十頁(yè)，共68頁(yè)。第四節(jié)其他原料的處理一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理（一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等流程如下：第四十一頁(yè)，共68頁(yè)。纖維原料粉碎水解中和澄清過(guò)濾發(fā)酵罐培養(yǎng)分離廢液種子營(yíng)養(yǎng)鹽菌體濃縮磨碎干燥成品第四十二頁(yè)，共68頁(yè)。

（二）利用檸檬酸中和濾液生產(chǎn)酵母

酵母菌種斜面一級(jí)種子二級(jí)種子離心分離中和廢液鹽酸調(diào)pH3.5發(fā)酵干燥粉碎包裝二次廢液用于發(fā)酵培養(yǎng)基的配置等第四十三頁(yè)，共68頁(yè)。二、亞硫酸鹽廢液的處理（一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋白質(zhì)1、亞硫酸鹽造紙制漿廢液生產(chǎn)酒精2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)3、亞硫酸銨法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP

（二）亞硫酸鹽廢液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸第四十四頁(yè)，共68頁(yè)。第五節(jié)培養(yǎng)基滅菌一、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用消毒：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消滅雜菌和防止雜菌污染第四十五頁(yè)，共68頁(yè)。二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）；1、干熱滅菌法灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱主要用于保持干燥的物料、器具等第四十六頁(yè)，共68頁(yè)。

2、濕熱滅菌法

借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。優(yōu)點(diǎn)：1）蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低廉，本身無(wú)毒2)蒸汽具有很強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌4）蒸汽輸送可借助本身的壓強(qiáng)，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易缺點(diǎn)：1)設(shè)備費(fèi)用高2）不能用于怕受潮的物料滅菌第四十七頁(yè)，共68頁(yè)。3、射線滅菌紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線化學(xué)藥品滅菌法（1）第一大類：表面消毒劑高錳酸鉀溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛37％、戊二醛、過(guò)氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類第四十八頁(yè)，共68頁(yè)。（2）第二大類：抗代謝藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大類：抗生素

第四十九頁(yè)，共68頁(yè)。三、加熱滅菌的原理

1.、微生物的熱阻：微生物對(duì)熱的抵抗力；致死溫度、致死時(shí)間2、微生物的熱致死動(dòng)力學(xué)：對(duì)數(shù)殘留定律第五十頁(yè)，共68頁(yè)。一級(jí)反應(yīng)：用N表示殘留活菌個(gè)數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即：式中，K是反應(yīng)速度常數(shù)，對(duì)滅菌來(lái)講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能測(cè)定。第五十一頁(yè)，共68頁(yè)。積分邊界條件：N0→Nθ；t0=0式中，θ滅菌時(shí)間（s）；N0滅菌開始時(shí)，培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)）；Nθ經(jīng)過(guò)滅菌時(shí)間θ后，殘存的活菌數(shù)（個(gè)）。

第五十二頁(yè)，共68頁(yè)。3、熱致死反應(yīng)的速度常數(shù)KK是表達(dá)微生物耐熱性的特征常數(shù)，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱第五十三頁(yè)，共68頁(yè)。第五十四頁(yè)，共68頁(yè)。第五十五頁(yè)，共68頁(yè)。4、滅菌溫度的選擇式中ΔE為菌體死滅反應(yīng)的活化能（J/mol），它是菌體死滅反應(yīng)的特征常數(shù)，所以，不同菌其熱死滅反應(yīng)的ΔE不同。第五十六頁(yè)，共68頁(yè)。第五十七頁(yè)，共68頁(yè)。四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡沫第五十八頁(yè)，共68頁(yè)。五、分批滅菌與連續(xù)滅菌一）、分批滅菌的操作過(guò)程（實(shí)罐滅菌）1）培養(yǎng)基的預(yù)熱培養(yǎng)基先加熱到80－90℃，然后再導(dǎo)入蒸汽升溫到120－180℃。目的：1）防止直接導(dǎo)入蒸汽時(shí)由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過(guò)大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋2）防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。方法：先將排氣閥打開第五十九頁(yè)，共68頁(yè)。2）培養(yǎng)基滅菌從各路通入蒸汽（進(jìn)氣口、排料口、取樣口），溫度升到120－130℃，保溫30min第六十頁(yè)，共68頁(yè)。2、分批滅菌的注意