細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù)

主講內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)和基本操作技術(shù)培養(yǎng)基及其配制

目前一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)第一部分實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)目前二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌）；無(wú)菌操作；控制培養(yǎng)。目前三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)從總體上來(lái)分，實(shí)驗(yàn)室主要分為兩類：基本實(shí)驗(yàn)室：輔助實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)目前四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)1、基本實(shí)驗(yàn)室：準(zhǔn)備室接種室培養(yǎng)室目前五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

作用

植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需器具的洗滌、干燥和保存；培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌；化學(xué)試劑的配制；重蒸餾水的生產(chǎn)等。

設(shè)計(jì)要求

面積20m2左右。通風(fēng)透光，地面防滑，墻面防潮。準(zhǔn)備室目前六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)▲實(shí)驗(yàn)臺(tái)架▲大、小水槽▲烘箱▲冰箱▲天平系列▲pH計(jì)▲高壓消毒鍋▲各種玻璃器皿▲藥品柜▲（磁力）攪拌器▲電爐▲蒸餾水器

設(shè)備目前七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)其中：玻璃器皿包括三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、移液管等移液槍（根據(jù)條件需要）由槍和槍頭組成其他：鍋、微波爐等目前八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)磁力攪拌器目前九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)電子天平萬(wàn)分之一百分之一目前十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)pH計(jì)目前十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)微量移液器蒸餾水器目前十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)－80℃－40℃0～4℃各式冰箱目前十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)接種室——也叫無(wú)菌操作室無(wú)菌操作室并非無(wú)菌，但應(yīng)該保持清潔作用

供外植體的接種，培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。目前十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)無(wú)菌室目前十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)設(shè)計(jì)要求

墻壁光滑平整，地面平坦無(wú)縫，除出入口和通氣口外，應(yīng)當(dāng)密閉，空氣不能對(duì)流，或者空氣經(jīng)凈化后進(jìn)入室內(nèi)。無(wú)菌室旁邊應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間內(nèi)應(yīng)有紫外燈，隨時(shí)可進(jìn)行滅菌。目前十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)無(wú)菌室內(nèi)的日常滅菌：定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微生物。使用前處理：用新潔爾滅（1：50）擦凈，然后用紫外燈照射滅菌至少20分鐘，操作前用70%酒精噴霧。思考：紫外燈如何殺菌？操作中要注意什么？目前十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)設(shè)備△紫外光燈△空調(diào)△放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培養(yǎng)基用；）△無(wú)菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。目前十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)△超凈工作臺(tái)：內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過(guò)濾裝置等每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過(guò)程中注意一直開(kāi)著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過(guò)濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。目前十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)其它部件：△離心機(jī)：分離原生質(zhì)體用；△點(diǎn)融合儀：細(xì)胞融合用。目前二十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)3培養(yǎng)室目前二十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

離體組織和試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的場(chǎng)所，應(yīng)為培養(yǎng)物創(chuàng)造適宜的溫、光、氣等條件。設(shè)計(jì)要求

培養(yǎng)室內(nèi)要求內(nèi)壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內(nèi)有足夠電源。

作用目前二十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)設(shè)備△

空調(diào)機(jī)：冷暖型△

加熱器△

定時(shí)裝置：控制光照時(shí)間△

培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶△

搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng)△

各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng)△

溫度計(jì)：控制溫度△

遮光簾：供暗培養(yǎng)之用目前二十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)2、輔助實(shí)驗(yàn)室：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室攝影室及暗室生化分析室目前二十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要設(shè)備

各種顯微鏡，顯微照相設(shè)備，切片、制片儀器設(shè)備，染色用具，暗房設(shè)備等。

作用

植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需隨時(shí)觀察記錄其細(xì)胞學(xué)和形態(tài)解剖學(xué)的變化，故要設(shè)置細(xì)胞顯微觀察室。目前二十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)熒光顯微鏡相差顯微鏡倒置顯微鏡普通顯微鏡目前二十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)理化分析試驗(yàn)室目前二十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)備配制小結(jié)基本設(shè)備：冰箱、天平、酸度計(jì)滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過(guò)濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無(wú)菌操作設(shè)備：凈化工作臺(tái)、接種箱目前二十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)光溫控制設(shè)備：時(shí)間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡目前二十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)第二部分

基本操作技術(shù)

基本操作技術(shù)主要是圍繞無(wú)菌操作技術(shù)展開(kāi)的一系列操作技能，內(nèi)容主要包括：

一．洗滌技術(shù)二．滅菌、消毒技術(shù)三、接種技術(shù)目前三十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)一、洗滌技術(shù)、洗滌目的：去除雜物，降低帶菌量、根據(jù)洗滌對(duì)象的不同，主要分為：器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷、不銹鋼器皿）培養(yǎng)材料洗滌目前三十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（一）器皿洗滌根據(jù)洗滌對(duì)象的具體情況可分為以下三種：特殊洗滌微生物大量污染的洗滌常規(guī)洗滌目前三十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

常規(guī)洗滌△自來(lái)水洗去油漬、霉菌等臟物；△溫肥皂水中浸泡一定時(shí)間后用刷子刷凈；△自來(lái)水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止；△蒸餾水淋洗內(nèi)外壁△將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃）△放入除塵柜中備用目前三十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

微生物大量污染的洗滌△

微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌特殊洗滌（如沾有蛋白質(zhì)類物質(zhì)或其它有機(jī)物時(shí))△

經(jīng)過(guò)常規(guī)洗滌未過(guò)蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數(shù)分至數(shù)小時(shí)；△

回收洗液，器具先用自來(lái)水洗凈，蒸餾水淋洗，烘干（75℃）目前三十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（二）、試驗(yàn)材料的清洗

清洗目的：來(lái)自自然界的試驗(yàn)材料，包括來(lái)自土壤中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細(xì)菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養(yǎng)基接觸，就會(huì)很快的繁殖起來(lái)，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。

清洗方法：先用自來(lái)水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑清洗，注意勿損傷試驗(yàn)材料。再用自來(lái)水流水沖洗半小時(shí)，用于下一步的藥劑滅菌。目前三十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)二、滅菌、消毒技術(shù)（一）關(guān)于有菌和無(wú)菌的概念有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。目前三十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）物理或化學(xué)處理；火烤后的物體；健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無(wú)菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）無(wú)菌的范疇：目前三十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（二）滅菌、消毒技術(shù)作用和意義

植物組培中，凡用于培養(yǎng)和無(wú)菌操作的房間、器具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料和操作者的衣物和手都應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長(zhǎng)繁殖速度一般都比培養(yǎng)的組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養(yǎng)容器內(nèi)部保持一個(gè)完全無(wú)菌的環(huán)境是絕對(duì)必須的。目前三十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（三）滅菌、消毒種類物理方法：

物理滅菌：高溫高壓滅菌（干熱/濕熱）、烘烤或灼燒滅菌、射線處理、超聲波等

物理除菌：過(guò)濾（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8微米等）、離心沉淀等；化學(xué)方法：使用滅菌劑，如薰蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新潔爾滅、次氯酸鈉、過(guò)氧化氫）

目前三十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)消毒、滅菌的對(duì)象：

★接種室

★材料（外植體）：完全殺死材料表面的微生物過(guò)程：洗潔精→酒精→氯化汞等

★器皿用具消毒（滅菌）★培養(yǎng)基目前四十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（三）、培養(yǎng)基、器具的滅菌用滅菌鍋滅菌：一般121℃，滅菌20分鐘。自動(dòng)鍋：加足水后，調(diào)好時(shí)間、溫度、即可自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)。手動(dòng)鍋:加足水后，關(guān)好，通電。待壓力升到0.5kg／c㎡時(shí)，打開(kāi)排氣閥排除鍋內(nèi)的冷空氣。然后關(guān)閉排氣閥，升至1.1kg／c㎡(121℃左右)時(shí)計(jì)時(shí)，用通電、斷電來(lái)保持20分鐘。待降至壓力為0時(shí)取出。器具的滅菌：也可用烘箱160℃，90～120分鐘目前四十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（四）、過(guò)濾除菌培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌或者兩者結(jié)合。另外酶等也需要過(guò)濾滅菌；滅菌方法：將激素或酶配成一定濃度，用注射器過(guò)慮，0.2－0.25微米。配制培養(yǎng)基時(shí)，先將培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度降至50℃左右時(shí)，加入適量的已過(guò)慮除菌的激素等，然后分裝。目前四十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（五）、外植體的選擇與消毒：1、外植體的選擇

選擇優(yōu)良的基因型：蔬菜等作物、花卉等觀賞植物等的脫毒快繁選優(yōu)良種。

取材：從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株上取材。母株代謝旺盛期取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)容易成功。

外植體大小選擇：如利用莖尖培養(yǎng)，脫毒快繁，莖尖大小對(duì)脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。

選擇外植體的時(shí)期目前四十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)2、外植體的消毒：取材將老的組織去掉自來(lái)水沖洗洗衣粉水洗（簡(jiǎn)單殺菌）自來(lái)水沖洗70％酒精處理消毒劑處理滅菌蒸餾水沖洗3－5遍。消毒時(shí)間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對(duì)殺菌時(shí)間較長(zhǎng)，反之，較短。一般殺菌，酒精10秒，升汞5－12分鐘。目前四十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格的滅菌，同時(shí)又要注意不損傷外植體。不同滅菌藥劑殺菌力不同，故在使用不同的藥劑時(shí)，需要考慮使用濃度和處理時(shí)間，對(duì)不同植物種類的不同外植體，處理也有不同。另外，外植體在進(jìn)入消毒劑之前，應(yīng)認(rèn)真取材及清洗，盡可能地減少其帶菌量。外植體除菌注意事項(xiàng)：目前四十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)消毒劑使用濃度(％)消毒時(shí)間(分)效果殘液去除難易次氯酸鈣105～30好易次氯酸鈉

2～55～30好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞

0.1～12～10最好最難過(guò)氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mg/L30～60較好較難幾種常用消毒劑的效果比較目前四十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)附：常用消毒劑的性質(zhì)70～75％酒精：

具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，常作為表面滅菌的第一步，它具有浸潤(rùn)和滅菌的雙重作用，但不能徹底滅菌，必須結(jié)合其他藥劑滅菌。一般處理時(shí)間為5～30s。為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1％的酸或堿，因?yàn)镠+和OH-可改變細(xì)胞膜帶電荷的性質(zhì)而使透性增加，提高殺菌的效果目前四十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)目前四十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)升汞（HgCl2）：

劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌原理是Hg2＋與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體酶蛋白變性失活。使用濃度0.1～0.2％，一般浸泡處理6～12min就可有效地殺死附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌，滅菌效果極好。但用升汞滅菌的外植體材料須用無(wú)菌水反復(fù)多次沖洗，才能洗去殘留的汞，否則會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用。通常用無(wú)菌水沖洗不得少于5次。由于升汞的毒性劇烈，使用中務(wù)必注意安全。目前四十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)升汞廢物的處理升汞為劇毒藥品，一則使用時(shí)注意別濺到皮膚上；二則使用后要進(jìn)行處理，不能直接倒入下水道。升汞處理方法：升汞＋Na2S絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）＋FeSO4（中和過(guò)多的Na2S）目前五十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)次氯酸鈉（NaClO）：用市售的“安替福民”配制2～10％的NaClO，滅菌時(shí)間5～30min，無(wú)菌水沖洗4～5次。由于它分解出具殺菌作用的氯氣，滅菌處理后易于除去，無(wú)殘留，既有較強(qiáng)的殺菌力，又對(duì)植物無(wú)害，是常用的殺菌劑。目前五十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)過(guò)氧化氫（雙氧水）：常用6～12％的溶液處理外植體材料，滅菌效果較好，由于該藥劑在外植體表面容易除去，又不會(huì)損傷外植體，通常用于葉片材料的滅菌。目前五十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)新潔爾滅：一種廣譜的表面活性滅菌劑，它對(duì)絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，滅菌效果很好。通常使用1：200稀釋液，處理30min或更長(zhǎng)。目前五十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)在用上述藥劑進(jìn)行材料的滅菌處理時(shí)，為了使殺菌劑濕潤(rùn)整個(gè)組織，有時(shí)還需在藥液中加入潤(rùn)濕劑。如加入數(shù)滴或0.1％的吐溫（Tween）80或吐溫20，或者用磁力攪拌、超聲振動(dòng)等方法使殺菌劑充分接觸外植體，以利于徹底滅菌。目前五十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)三、接種技術(shù)1所有的消毒、接種等無(wú)菌操作技術(shù)均需在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。1、超凈工作臺(tái)：內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過(guò)濾裝置等，每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過(guò)程中注意一直開(kāi)著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過(guò)濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。2、無(wú)菌操作用的器具：刀、鑷子、剪刀、酒精燈等事先已滅菌，使用中避免交叉污染；3、操作人員在操作之前洗手、換工作服、雙手消毒再操作。目前五十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)培養(yǎng)條件光照:光照強(qiáng)度、光質(zhì)、光照時(shí)間溫度濕度pH值：5.5～6.5滲透壓通氣條件目前五十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)根據(jù)離體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，培養(yǎng)基至少包括：

無(wú)機(jī)鹽；有機(jī)化合物；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑三、培養(yǎng)基及其配制目前五十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)培養(yǎng)基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、大量元素：C、H、ON、P、K、Ca、Mg、S、(Na)、微量元素：目前五十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)無(wú)機(jī)鹽的作用：一是組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；二是構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動(dòng)；三是這些元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學(xué)方面的作用；四是在發(fā)育過(guò)程中，影響組織器官的建成。目前五十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)濃度：2%-3%2有機(jī)物質(zhì)糖：作用：維持培養(yǎng)基合適的滲透壓為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量種類：蔗糖、葡萄糖麥芽糖、果糖等多糖：可溶性淀粉目前六十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)維生素：硫胺素(VB1)、煙酸（VB3又稱VBPP）、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等等.作用：利于細(xì)胞代謝和器官分化。B1是植物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30mg/L之間，當(dāng)組培中細(xì)胞分裂素特別少時(shí)，B1更為需要；煙酸和B6可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)目前六十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其添加種類和濃度不同。肌醇：又稱環(huán)己六醇，促進(jìn)糖類的相互轉(zhuǎn)化，維生素、激素的利用作用，使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)。腺嘌呤、硫酸鹽等激素：加入培養(yǎng)基時(shí)，可促進(jìn)芽、根的形成和生長(zhǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基的植物不同，決定是否添加。目前六十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)瓊脂:是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，但不參與代謝。

活性炭:主要目的是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。

3、附加物這類物質(zhì)為非植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必須，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利,主要包括瓊脂和活性炭。目前六十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)作用：提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。這類物質(zhì)常指天然提取物：

麥芽提取物、

椰乳、

鮮果汁、

酵母提取物4、其它有益有機(jī)添加物或未知復(fù)合成分目前六十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)5、pH值：即酸堿度，培養(yǎng)的植物材料大多數(shù)要求弱酸性的環(huán)境，一般將培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.6—5.8。常用0.1mol/l氫氧化鈉或鹽酸來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。注意：第一、經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH會(huì)下降0.2-0.8,故調(diào)整后的pH應(yīng)該高于目標(biāo)pH0.5個(gè)單位；第二、pH的大小會(huì)直接影響到瓊脂的凝固能力，一般pH大于6.0時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變硬，低于5.0時(shí)瓊脂就不能很好地凝固。目前六十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)6、激素

在培養(yǎng)基中，其各種成分對(duì)培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會(huì)顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等；

組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。目前六十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（一）、激素的種類1、生長(zhǎng)素2、細(xì)胞分裂素3、赤霉素4、脫落酸目前六十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)1、生長(zhǎng)素類

生長(zhǎng)素是指能引起完整組織中的細(xì)胞擴(kuò)展的化合物。

在自然界中，即內(nèi)生生長(zhǎng)素影響莖和莖節(jié)的伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象

在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，促進(jìn)生根。目前六十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素有：

二氯苯氧乙酸（2，4－D）

；

萘乙酸（NAA）

吲哚乙酸（IAA）

；

吲哚－3－丁酸（IBA）

萘氧乙酸（NOA）

；

對(duì)氯苯氧乙酸（P-CPA）

三氯苯氧乙酸（2，4，5－T）；

生根粉（ABT）NAA、IAA、IBA易引起生根，2，4－D、2，4，5－T有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。

目前六十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)主要作用：是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?，4-D>NAA>IBA>IAA目前七十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)溶解方法：0.1MNaOH或95％酒精，以前者為好

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存目前七十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)2、細(xì)胞分裂素

自然界中，細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂，頂端優(yōu)勢(shì)的變化和莖的分化等；

組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和愈傷組織上或器官上分化不定芽，葉片擴(kuò)大和莖長(zhǎng)高，抑制根的生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂素常常與生長(zhǎng)素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官形成。目前七十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)常用的細(xì)胞分裂素有：

6－芐基嘌呤（BAP）；6－芐基腺嘌呤（6－BA）；激動(dòng)素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）；玉米素（ZT）；異戊烯氨基嘌呤（2－IP）噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）；

溶解方法：0.1MHCL保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存目前七十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)主要作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)側(cè)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其他的激素作用；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篫T>2-iP>6-BA>KT。

目前七十四頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)3、赤霉素赤霉素能夠打破休眠、促進(jìn)果實(shí)成長(zhǎng)等效果；赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3；已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究；能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株；在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。目前七十五頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

溶解方法：95％酒精

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存；赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解；

滅菌：高溫分解，過(guò)濾滅菌。目前七十六頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)4、脫落酸脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用；加上脫落酸能抑制生長(zhǎng)，使繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)；溶解方法：95％酒精；保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。目前七十七頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（二）、常見(jiàn)培養(yǎng)基中植物激素配方類型激素配方再生方式及用途1.無(wú)植物激素誘導(dǎo)生根、無(wú)性胚、愈傷組織形成2.單加生長(zhǎng)素誘導(dǎo)生根、愈傷組織、無(wú)性胚、不定芽3.單加細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖、愈傷組織形成4.高生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長(zhǎng)素高細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)叢芽、愈傷組織形成6.低生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖7.等量生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)側(cè)芽增殖8.加生長(zhǎng)仰制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長(zhǎng)、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進(jìn)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)目前七十八頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)名稱分子量溶解性質(zhì)主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進(jìn)細(xì)胞的延伸生長(zhǎng)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松馳，也可用于誘導(dǎo)生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚、稀堿、稀酸液為生根刺激劑a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進(jìn)愈傷組織形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進(jìn)莖、葉伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，打破休眠（三）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表目前七十九頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（四）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的轉(zhuǎn)換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173目前八十頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)三、常用培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn)（一）、培養(yǎng)基的種類1、培養(yǎng)基，根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)基中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來(lái)第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來(lái)接種繼初代培養(yǎng)基之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。

目前八十一頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)

3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。4、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。目前八十二頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)（二）幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基：MS、N6、B5、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMⅡ、米勒、改良懷特、尼特、努森C等。MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培生長(zhǎng)所需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡目前八十三頁(yè)\總數(shù)八十九頁(yè)\編于二十一點(diǎn)四、培養(yǎng)基的配制