第十二章血痕檢驗(yàn)

第十二章血痕檢驗(yàn)第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四血痕檢驗(yàn)需要解決的問題送檢檢材是否是血痕。如果是血痕，是人血還是動(dòng)物血。若是人血，則測(cè)定遺傳標(biāo)記進(jìn)行個(gè)人識(shí)別同時(shí)進(jìn)行其他諸如出血量、出血時(shí)間及出血部位推斷等問題。第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四四、DNA檢驗(yàn)(一)根據(jù)Alu序列作種屬鑒定哺乳類動(dòng)物細(xì)胞DNA有一種中度重復(fù)序列，重復(fù)單位長(zhǎng)約300bp。其中在170bp附近有限制性內(nèi)切酶Alu切割的AGCT序列，命名為“Alu'’家族。Alu序列為人和靈長(zhǎng)類所特有，具有種屬特異性。對(duì)血痕檢材用PCR擴(kuò)增Alu家族進(jìn)行檢測(cè)，可作為種屬鑒定。第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四引物序列：Alu9.15'-GGCACTTTGGGAGGCCAAGG-3’Alu9.25'-TACAAGCTTGTGCCACCATGCCCAAC-3’擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，可獲得DNA長(zhǎng)度為130bp的特異性條帶。牛、大鼠、蛙、鯽魚等的擴(kuò)增片段大于130bp，且擴(kuò)增產(chǎn)量非常少。除猴血外，其他動(dòng)物均無擴(kuò)增產(chǎn)物。第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(二)根據(jù)28SrRNA序列鑒定種屬人類rRNA由60s和40s大小的兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中60s又由28s、5.8s和5s三個(gè)亞基組成。大部分28srRNA編碼序列的區(qū)域進(jìn)化緩慢，相對(duì)保守，但保守區(qū)中的可變區(qū)進(jìn)化較快，種屬之間差異較大。針對(duì)這一區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得人和動(dòng)物有差異的特異性片段。引物A：5’一ATCTAGTAGCTGGTTCCCTC-3引物B：5'-CCTCTAATCATTCGCTTTAC-3’經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，人類DNA擴(kuò)增片段為108、104、101及99bp，主要產(chǎn)物為99bp，不同動(dòng)物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同。第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(三)細(xì)胞色素b基因序列進(jìn)行種屬鑒別細(xì)胞色素b基因位于mtDNA上，是一個(gè)具有種屬差異的遺傳標(biāo)記，幾乎所有的生物檢材都可檢驗(yàn)。由于mtDNA拷貝數(shù)遠(yuǎn)多于核DNA，檢測(cè)的靈敏度較高。人和其他哺乳動(dòng)物的細(xì)胞色素b基因片段均存在AluI酶切位點(diǎn)，但酶切片段大小不同，可區(qū)分人與其他哺乳動(dòng)物。第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四引物序列：引物1：5’一CATCGACCTTCCAGCCCCATCAAACAT-3’引物2：5~-TGTTCTACTGGTTGGCCTCCAATTCA-3’PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，可見一條981bp長(zhǎng)的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種限制酶切割(AluI、NcoI)，酶解產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用銀染色方法顯現(xiàn)酶解片段。人類與動(dòng)物酶切片段大小不同。第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第六節(jié)血痕的個(gè)人識(shí)別檢材確定為人血后，應(yīng)測(cè)定血痕中的遺傳標(biāo)記。選擇原則：①良好的遺傳多態(tài)性；②較穩(wěn)定；③檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化、簡(jiǎn)單、結(jié)果重復(fù)性好。第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四一、血痕的血型測(cè)定ABO血型抗原對(duì)高溫、腐敗有相當(dāng)?shù)哪褪苄?，而且抗原性很?qiáng)、穩(wěn)定，可以在血痕中保存相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間。ABO血型物質(zhì)不僅紅細(xì)胞上有，其他人體組織細(xì)胞也存在ABO抗原，這些特征在法醫(yī)物證檢材的個(gè)體識(shí)別中具有重要實(shí)際意義。ABO血型是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中個(gè)人識(shí)別的傳統(tǒng)檢測(cè)項(xiàng)目。第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(一)吸收試驗(yàn)吸收試驗(yàn)(absorptiontest)又稱吸收一抑制試驗(yàn)(absorption-inhibitiontest)。第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

原理：血痕中A、B、H血型物質(zhì)能與相應(yīng)的抗-A、抗-B、抗-H抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，使抗血清中的游離抗體減少或消失，不能再與相應(yīng)的A、B、O型指示紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。若血痕中無某種ABH抗原，則不能抑制抗血清中的相應(yīng)抗體，抗體與相應(yīng)的指示紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)，其反應(yīng)的強(qiáng)度沒有變化。根據(jù)抗血清在與血痕吸收反應(yīng)前后的效價(jià)改變情況，可推斷血痕所含的血型抗原種類，判斷血痕的ABO血型。第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四方法：取血痕3塊，大小lcm~0.5cm，剪碎，置于試管中，分別加效價(jià)為16～32的抗-A、抗-B、抗-H血清各0.1ml。與檢材充分混合后，置4℃冰箱吸收12～24h。離心取上清液測(cè)定吸收后的抗體效價(jià)。以檢材無血痕部分作為陰性對(duì)照，用已知人A、B、O型血痕作為陽性對(duì)照。第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果判斷：檢材無血痕部分吸收后抗體效價(jià)不降低，而待測(cè)血痕吸收后抗體效價(jià)比空白檢材低3級(jí)或3級(jí)以上為陽性。綜合抗-A、抗一B及抗-H血清試劑吸收的級(jí)數(shù)，判斷血痕中所含的ABH抗原，確定血痕的ABO血型。第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(二)解離試驗(yàn)解離試驗(yàn)(elutiontest)又稱吸收一解離試驗(yàn)(absorption-elutiontest)。

原理：血痕中的A、B、H抗原能與相應(yīng)的抗-A、抗一B、抗一H抗體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)。這種特異性結(jié)合是可逆的，56℃加熱后，血痕上抗原結(jié)合的抗體可以解離下來。用已知的A、B和。指示紅細(xì)胞檢測(cè)解離液中抗體。紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集者為解離試驗(yàn)陽性，紅細(xì)胞不凝集者為解離試驗(yàn)陰性。綜合反應(yīng)結(jié)果，可判斷血痕的ABO血型。第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四方法：剪取血痕纖維3段，長(zhǎng)各0．5cm，甲醇固定l0min，揮干后分別置3支小試管中，分別加效價(jià)為64的抗-A、抗-B、抗-H血清，室溫放置30～60min。生理鹽水洗滌數(shù)次，分別加0.1％濃度的A、B和0指示紅細(xì)胞懸液1滴，置于56℃溫箱5～10min后，除去血痕纖維，懸液稍離心，傾倒于載玻片上，鏡檢。鏡下紅細(xì)胞凝集者為陽性反應(yīng)；不凝集者為陰性反應(yīng)。以檢材無血痕部分作為陰性對(duì)照，已知A、B、O型血痕作為陽性對(duì)照。第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四解離試驗(yàn)的特點(diǎn)是：①實(shí)驗(yàn)靈敏度高，檢材用量少，適用微量血痕的血型測(cè)定。②實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間較短，實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備簡(jiǎn)單。③實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，其中洗滌步驟是關(guān)鍵，洗多容易出假陰性；洗少容易出假陽性結(jié)果。④抗體效價(jià)應(yīng)高于64。⑤必須設(shè)置已知A和B型血痕對(duì)照。選擇對(duì)照血痕時(shí)應(yīng)注意與檢材血痕濃度相當(dāng)、時(shí)間相近、基質(zhì)相同。第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(三)血痕凝集素測(cè)定原理：血痕的血清成分含有抗-A、抗一B凝集素，用凝集原來測(cè)定血痕中的凝集素，也可以判斷血痕的ABO血型。第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四方法：取血痕3塊(0.2×0.2cm)，分別置于標(biāo)明A、B、O的三塊載玻片上，按標(biāo)記滴加0.2%A、B、O型紅細(xì)胞懸液于各載玻片上，蓋上蓋玻片，使紅細(xì)胞懸液彌散整個(gè)蓋玻片。置室溫濕盒1h，鏡檢，觀察血痕周圍出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集為陽性反應(yīng)，表明檢材中含有與紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)的抗體；不凝集為陰性反應(yīng)。第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四血痕四周出現(xiàn)A型紅細(xì)胞凝集時(shí)，表示血痕含有抗-A凝集素；與B型紅細(xì)胞凝集時(shí)，表示含有抗-B凝集素。血痕中凝集素不如抗原穩(wěn)定，室溫下血痕凝集素保存時(shí)間大約1個(gè)月。較陳舊或水洗的淡泊血痕不易有陽性結(jié)果，所以凝集素測(cè)定的意義在陽性結(jié)果，陰性結(jié)果沒有意義。第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四二、血痕的血清型測(cè)定應(yīng)用于法醫(yī)血痕檢驗(yàn)的僅有Hp、Gc、Gm及Km等少數(shù)幾種。血痕血清型的檢驗(yàn)方法多用電泳方法。血痕中紅細(xì)胞均已破碎，電泳前檢材血痕溶解液中含有大量的血紅蛋白。血清蛋白和血紅蛋白形成的譜帶都被染上色，形成譜帶，干擾血清型的分型。第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四檢測(cè)血痕Hp采用氯仿提取血紅蛋白的方法。提取方法：取檢材1cm2，剪碎置小試管，加25％蔗糖液0.1ml，充分混合，浸泡2～3min。離心后取出纖維，加0.3ml氯仿，震蕩，離心3000r／min15min。溶液分成上中下三層，下層為氯仿，中層為變性血紅蛋白，上層為微帶紅色的液體含Hp-Hb復(fù)合物，取上層液電泳檢測(cè)。因?yàn)橛醒t蛋白的干擾，血痕中Hp檢測(cè)有一定的困難。血痕越陳舊，干擾愈明顯。第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四血痕中GC分型采用4mol／L鹽酸胍處理血痕浸液，可使GC-actin復(fù)合物解離，GC游離，恢復(fù)正常的電泳遷移率。但在鹽酸胍處理過程中，GC蛋白損失約72%，故不適用檢測(cè)微量血痕中的GC表型。血痕GC與血清GC的IEF譜帶不完全相同，前者除具有后者的電泳區(qū)帶外，尚有GC-actin復(fù)合物的附加帶，除GC2-2型的附加帶位于GClS與GC2蛋白帶之間以外，其余5種亞型的附加帶均位于GClS蛋白帶的陽極側(cè)。第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四三、血痕的紅細(xì)胞酶型測(cè)定血液紅細(xì)胞酶型分型主要采用電泳分離與酶活性顯色相結(jié)合的方法。需要強(qiáng)調(diào)的是，酶活性容易受溫度和濕度的影響，對(duì)熱的耐受力也較差。大多數(shù)酶型的酶活性只能在血痕中保持較短的時(shí)間。在37~C條件下，血痕中紅細(xì)胞酶的活性一般只能維持?jǐn)?shù)天，而4℃保存的血痕，紅細(xì)胞酶的活性可保存的時(shí)間有很大不同，幾天、幾周、幾月不等。第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四酶蛋白在血痕中的改變主要有三方面：①酶的活性喪失②酶的結(jié)構(gòu)改變，在這種情況下，酶的活性盡管還存在，但由于酶的遷移率的不規(guī)則，無法確定其型別。③在還原型谷胱甘肽的參與下，一些酶可形成可逆的二硫化物，由于谷胱甘肽有一個(gè)凈負(fù)電荷，使復(fù)合物所帶更多的負(fù)電荷。第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四四、血痕的DNA分析血痕的DNA分析目前已成為常規(guī)技術(shù)，技術(shù)的關(guān)鍵在于DNA的提取。第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四有機(jī)溶劑法提取的DNA純度較高，基本提取步驟為：剪碎血痕，置于1.5ml離心管中，加400μl提取緩沖液(10mmol／LTris，10mmol／LEDTA，10mmol／LNaCl，39mmol／LDTT，2％SDS)及l(fā)0ul蛋白酶K(20mg／m1)，56℃過夜，加500ul酚／氯仿／異戊醇的混合液(25：24：1)，抽提蛋白質(zhì)，用冷乙醇沉淀DNA，再用70%乙醇洗滌。吸去乙醇，沉淀干燥，再溶于TE緩沖液或無菌蒸餾水中。第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四血痕個(gè)人識(shí)別主要用STR基因座分型，其次為序列多態(tài)性如HLA-DQ、PM及mtDNA等的檢測(cè)。第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四五、血痕的性別鑒定判定血痕性別可檢查X和Y染色質(zhì)，也可測(cè)定性激素，或用DNA分析。前兩種方法難免有誤判，而后一種方法結(jié)果可靠。DNA分析包括：Y染色體特異性探針雜交技術(shù)、Y染色體特異性酶切片段、PCR擴(kuò)增Y染色體特異性片段、PCR擴(kuò)增X、Y染色體特異性片段等。目前主要采用同時(shí)擴(kuò)增X、Y兩條染色體的特異性片段、Y染色體特異性片段。第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(一)牙釉基因(amelogenin，AMG)牙釉基因位于X染色體Xp22，編碼牙原基質(zhì)牙釉質(zhì)蛋白，故名牙釉基因。用一對(duì)特異性引物可同時(shí)擴(kuò)增AMG和AMGL序列片段，X特異性片段長(zhǎng)977bp，Y特異性片段長(zhǎng)788bp。引物：AMXY-1F5-CTGATGCTTGGCCTCAAGCCTGTG-3AMXY-2F5-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(二)Zw／ZFX基因ZFY基因位于Y染色體短臂，它編碼一種鋅指狀蛋白；ZFX基因位于X染色體上，與ZFY基因有同源序列。設(shè)計(jì)三個(gè)引物同時(shí)擴(kuò)增Y染色體及X染色體特異性的ZFY基因和ZFX基因的DNA片段來確定性別。位于Y染色體的ZFY基因片段長(zhǎng)340bp，位于X染色體的ZFX基因片段長(zhǎng)488bp。因此女性只有一條488bp的譜帶，男性有340bp和488bp兩條譜帶。第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(三)擴(kuò)增Y染色體特異DNA片段針對(duì)Y染色體特異性片段設(shè)計(jì)的鑒定性別的引物有數(shù)對(duì)。由于為Y染色體特有，必須同時(shí)擴(kuò)增男女共有的片段作為對(duì)照，故常用人類Alu片段作對(duì)照。Alu片段長(zhǎng)度為130bp，擴(kuò)增結(jié)果：男性具有Y染色體特異擴(kuò)增條帶和Alu帶；女性只有Alu帶；無Alu帶為擴(kuò)增失敗。常用的Y染色體特異DNA片段有DYZl。DYZl序列是Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)區(qū)3.4kb的重復(fù)序列，在Y染色體上拷貝數(shù)為5000。第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四六、血痕的其他檢驗(yàn)(一)出血部位的