JJF 1974-2022 生物降解試驗中接種物活性定量測量方法

中華人民共和國國家計量技術規(guī)范2生物降解試驗中接種物活性定量測量方法etfs8發(fā)布 8實施國家市場監(jiān)督管理總局 發(fā)布2生物降解試驗中接種物活性定量測量方法etdns

2歸 口 單 位:全國生物計量技術委員起 草 單 位:上海市檢測中心中國計量科學研究院生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學品管理技術中心本規(guī)范委托全國生物計量技術委員會負責解釋本規(guī)范起草人:陳曉倩上海市檢測中心)王晶中國計量科學研究院傅博強中國計量科學研究院楊希晨上海市檢測中心)劉亞楠上海市檢測中心)唐治玉中國計量科學研究院)楊力生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學品管理技術中心)目 錄引言………………………

Ⅱ)1范圍……………………2引用文件………………3術語和計量單位………………………4概述……………………5測量條件………………1環(huán)境條件……………2儀器…………………3試劑…………………4材料…………………6測量方法………………1標準曲線的建立……………………2樣品制備……………3樣品的活性定量……………………4測量重復性的計算…………………7質(zhì)量控制………………8不確定度的評定及表述………………

1)1)1)2)2)2)2)2)2)3)3)3)4)4)4)5)附錄A 試驗溶液的配制………………

6)附錄B 生物降解試驗中接種物活性定量測量應用實例……………

8)附錄C 原始記錄格式推薦性表格)………………

)附錄D 測試報告內(nèi)頁推薦格式………

)Ⅰ引 言本規(guī)范依據(jù)0國家計量校準規(guī)范編寫規(guī)則1通用計量術語及定義》和2測量不確定度評定與表示》制定,主要參考M5水中微生物三磷酸腺苷)含量標準檢測方法》dtefn]和0P熒光檢測儀校準規(guī)范》制定。本規(guī)范為首次發(fā)布。Ⅱ生物降解試驗中接種物活性定量測量方法范圍本規(guī)范適用于環(huán)境風險評估中生物降解試驗所使用的接種物活性的定量測量。引用文件本規(guī)范引用了下列文件6常用玻璃量具5化學分析測量不確定度評定5生物計量術語及定義8P熒光檢測儀校準規(guī)范3化學品測試導則( )1化學品測試準則

sM2水中微生物三磷酸腺苷)含量標準檢測方法tefn]凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本規(guī)范凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本規(guī)范。術語和計量單位、3和D中界定的及以下術語和定義適用于本規(guī)范。生物降解試驗 t評估受試物被接種物一般含微生物)分解為2、水、礦物鹽和新的細胞代謝物的能力的試驗。接種物m生物降解試驗過程中用于接種的含有活性微生物的試驗生物,

包括地表水

、生活污水處理廠二級出水、生活污水處理廠活性污泥等中的微生物群落。在特定環(huán)境下生長的不同種的微生物在生理和生存過程中具有一定的聯(lián)系通過微生物群落 y, ,在特定環(huán)境下生長的不同種的微生物在生理和生存過程中具有一定的聯(lián)系通過它們之間相互作用,使群體協(xié)調(diào)發(fā)展,并且具有一定功能的微生物的組合。相對光單位U三磷酸腺苷e,)水解成一磷酸腺苷e)和焦磷酸鹽時釋放化學能驅(qū)動熒光素在熒光素酶催化下氧化釋放的光量子數(shù)的測量單位。注非單位,但與P濃度成比例關系。不同的檢測儀對于同樣的樣品可能會產(chǎn)生不同的讀數(shù)。1概述生物降解性用于評估化學物質(zhì)與接種物接觸表現(xiàn)出被生物降解的潛力,是鑒定化學物質(zhì)的環(huán)境危害性和持久性、進行分類和標簽、評價和控制環(huán)境風險的基本指標。接種物活性是生物降解性中的主要內(nèi)容。通過接種物活細胞數(shù)量的多寡反映微生物能量代謝的活性,判斷其活性是否符合生物降解試驗的要求作為接種物影響生物降解結果的指標。本規(guī)范采用法測量接種物中的活細胞濃度。法是將接種物中的經(jīng)提取后測量在氧氣、和鎂離子同時存在下熒光素酶催化熒光素氧化產(chǎn)生的m黃綠色光強度。在一定范圍內(nèi),光強度與P濃度成正比例關系。光強度用發(fā)光檢測儀熒光檢測儀、微孔板化學發(fā)光檢測儀等測量,結果用相對光單位)表示。根據(jù)相對光單位強度可以推算出接種物中的P濃度。通常每個微生物細胞中的P含量相對恒定,約65gl或9,由此可以計算得到接種物中的活細胞濃度。測量條件環(huán)境條件溫度℃。儀器發(fā)光檢測儀:檢測范圍不低于4個數(shù)量級,線性誤差小于0。2移液器L或,L各1支。電子天平:分度值為1。高速大容量離心機:離心力不低于g。水分儀:分度值為1。試劑三磷酸腺苷)二鈉鹽純度標準物質(zhì)以下簡稱P二鈉鹽擴展不確定度1 。標準工作液:配制見附錄。檢測試劑:主要包括提取劑、熒光素和熒光素酶。注建議使用含有提取劑的商業(yè)化檢測試劑盒具體實施依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家的要求實施。高壓滅菌水或無菌水:無菌、。礦質(zhì)培養(yǎng)基:詳見附錄。材料無菌塑料離心管)。不透光的6孔板或其他與發(fā)光檢測儀適配的器皿。2測量方法標準曲線的建立 ,

, /、 /、配制P標準工作液

應設置至少5個不同的濃度

如lLlL,也可根據(jù)實際情況設置濃度范圍。移液器分標準工作液,熒光素酶混合試劑混合反應。用發(fā)光檢測儀檢測并記錄相對光強度。每個濃度標準工作液設定3個平行,以3次測量的相對光強度的平均值作為該濃度標準工作液的平均相對光強度。nn以平均相對光強度)和P標準工作液的濃度)繪制標準曲線,進行線性擬合,得到標準曲線方程式。按式)計算線性相關系數(shù),取5的濃度范圍作為線性范圍。5時,則去掉最高濃度點,再增加5倍最高濃度點,與余下的濃度點重新繪制標準曲線,直至。nn∑( ∑( 1ii) 1ix∑( ∑( y= nix2i=1n

x

nixi=1

)∑ni2∑( r=1∑ni2∑( r=nn

)式中:線性相關系數(shù)

i2×i=1ii個測量點的P標準工作液濃度;用于計算線性范圍的測量點的P標準工作液濃度的平均值;ii個測量點的平均相對光強度;用于計算線性范圍的測量點的相對光強度的平均值;用于計算線性范圍的測量點的個數(shù)。樣品制備生物降解試驗中的接種物可以有多種來源水、地表水或這幾種的混合物。

包括活性污泥、

污水處理廠二級出當接種物為活性污泥或多種接種物的混合物時,可利用離心法以g的離心力離心0)或沉降法自然沉淀后倒去上清液)等預處理方法去除表面雜質(zhì),用礦質(zhì)培養(yǎng)基)進行清洗至少3次。用水分儀試驗條件為5℃)測定干重,用培養(yǎng)基配制成濃度適宜的懸液作為待測樣品詳見附錄。當接種物為污水處理廠二級出水時,可沉淀1h或用粗濾紙過濾,取上清液或濾出液作為待測樣品。當接種物為地表水時,如有必要,可通過過濾或離心將接種物濃縮作為待測樣品。還可使用商業(yè)化接種物作為生物降解試驗的接種物具體配制方法可參照商品3使用說明書或其他相關作業(yè)指導書。應在樣品制備完成后保存在℃,并在4h內(nèi)完成樣品P濃度的測量。樣品的活性定量移液器量取樣品溶液

提取劑處理

,釋放ATP。加入熒光素熒光素酶混合試劑,充分混合反應。注步驟1和2可依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家規(guī)定的使用要求進行調(diào)整。用發(fā)光檢測儀測量并記錄相對發(fā)光強度。步驟1至2重復6次,將6次測量的相對發(fā)光強度的平均值作為樣品的平均相對發(fā)光強度,代入式)中,計算得到樣品P濃度的測量值。按式)計算樣品中活細胞濃度的范圍。C x1

)式中:活細胞濃度1

l=Vx樣品P濃度的測量值;1樣品稀釋后總體積;V樣品體積;每個活細胞中的P含量的理論值98。測量重復性的計算n1i2n以n1i2nRSD=1

D值0

表示的測量重復性按)y式中:測量重復性相對標準偏差;i樣品第i次測量的相對光強度;樣品n次測量的平均相對光強度;測量次數(shù)。質(zhì)量控制以平均相對光強度)和P標準溶液濃度)繪制標準曲線的線性相關系數(shù)r應不小于;單樣品6次測量結果的相對標準偏差不得超過0;使用前,應保證儀器設備的計量溯源性;測量過程中,應保證所有儀器設備的有效性。4不確定度的評定及表述生物降解試驗中法進行接種物活性的定量,測量結果的不確定度來源包括樣品體積V)引入的相對標準不確定度V、P濃度測量C)引入的相對標準不確定度C。nni212,…n=

)其中y12,…n)為幾個參數(shù)12,…n的函數(shù)i為靈敏系數(shù)當各不確定度分量互不相關時,靈敏系數(shù)為V2V2C2此測量結果的相對合成標準不確定度表示為:

各不確定度分量互不相關因其中l(wèi)其中l(wèi)的不確定分量包括樣品制備引入的相對標準不確定度和測試樣品體

l=

)積引入的相對標準不確定度C)的不確定分量包括標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度、標準曲線線性擬合引入的不確定度最小二乘法擬合以及樣品測量引入相對標準不確定度。各輸入量的不確定度來源及評定方法見表各輸入量的相對標準不確定度分量的計算方法參見附錄。相對擴展不確定度表示為:llk)表1測量結果的不確定度來源及評定輸入量的標準不確定度不確定度來源評定方法輸入量的相對標準不確定度分量V)測試樣品體積及稀釋體積B類環(huán)境溫度變化B類C)標準物質(zhì)純度B類標準曲線線性擬合B類測量結果重復性A類發(fā)光檢測儀B類5附錄A礦質(zhì)培養(yǎng)基的配制

試驗溶液的配制,生物降解測試方法中的接種物試驗體系由礦質(zhì)培養(yǎng)基配制 具體使用的試劑及配制方法示例見表。表1礦質(zhì)培養(yǎng)基的配制貯備液成分/)貯備液)40454O0l5貯備液)20或2O0貯備液)4O0貯備液)3O5礦質(zhì)培養(yǎng)基將0L貯備液)加0L無菌水,再加貯備液、貯備液)和貯備液)各1,加無菌水定容到1LH在。礦質(zhì)培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用,不保存。如果貯備液出現(xiàn)沉淀,則需重新配制系列標準工作液的配制試劑與材料二鈉鹽純度標準物質(zhì)。高壓滅菌水或無菌水:無菌、。離心管無菌、。儀器電子天平

分度值為1。2移液器L或,L各1支。系列標準工作液的配制根據(jù)二鈉鹽純度標準物質(zhì)的純度,計算并精密稱取一定量的二鈉鹽純度標準物質(zhì)置于2離心管中加無菌水充分溶解混勻得到濃度為6L的P標準母液。每次臨用前新鮮配制。取P標準母液,置于離心管中,加水,混勻,得到P標準中間液,濃度為4。6取濃度為4L的P標準中間液,置于離心管中,加水,混勻,得到P標準工作液,濃度為。重復上一步稀釋方法,通過0倍梯度稀釋,得到系列P標準工作液,濃度依次為。7附錄B生物降解試驗中接種物活性定量測量應用實例儀器與試劑儀器 :

( ) 。微孔板化學發(fā)光檢測儀

線性誤差的擴展不確定度

2為3電子天平,分度值為1。水分儀:分度值為1。高速大容量離心機:加速度不低于g約0。試劑

: , ( 。 二鈉鹽純度標準物質(zhì)

純度為2

擴展不確定度U7

k=2檢測試劑盒。高壓滅菌水或無菌水。礦質(zhì)培養(yǎng)基:具體使用的試劑及配制方法見附錄。樣品制備本次測量的樣品為某生活污水處理廠曝氣池采集的活性污泥。

污水處理廠的處理工藝為厭氧好氧法。污泥使用前保持曝氣狀態(tài)盡可能減少從污水處理廠到實驗室的轉(zhuǎn)運未曝氣狀態(tài)。樣品制備過程 :

, ( , )用礦質(zhì)培養(yǎng)基清洗污泥

每次加入礦質(zhì)培養(yǎng)基混勻后

離心g4℃0。離心分離后去除上清液,該程序重復3次。取g洗過的污泥用水分儀測定干重,條件為5℃。根據(jù)處理后污泥干重計算配制污泥懸浮液所需取用污泥的量。取適量離心過的污泥分散于1L的礦質(zhì)培養(yǎng)基,配制干重濃度為L的活性污泥懸浮液,攪拌器攪勻后攪拌曝氣待用。取濃度為L的活性污泥懸液0,加礦質(zhì)培養(yǎng)基0,混勻,得到濃度為0L的活性污泥懸浮液。取濃度為0L的活性污泥懸液0,加礦質(zhì)培養(yǎng)基0,混勻,得到濃度為0L的活性污泥懸浮液。標準曲線的建立 , ,稱取P二鈉鹽純度標準物質(zhì)0

置于離心管中

加水0L充分溶解混勻,得到P標準母液,濃度為6。按附錄2至4的步驟,配制濃度分別為、L和L的P標準工作液。按檢測試劑盒的說明書,將試劑盒中的緩沖液轉(zhuǎn)移到含有熒光素酶的凍干粉中混勻溶解,得到底物溶液。81。將反應液放入微孔板化學發(fā)光檢測儀中,測定反應液的相對發(fā)光強度。將0L底物溶液與01。將反應液放入微孔板化學發(fā)光檢測儀中,測定反應液的相對發(fā)光強度。

每個濃度的標準工作液進行3次平行測量,取以3次測量的熒光示值的標準工作液的平均相對發(fā)光強度。平均值作為該濃度以平均相對光強度U)和P標準工作液的濃度)繪制標準曲線,進行線性擬合,得到標準曲線方程,計算相關系數(shù)r,見表。表1P標準工作液的測量結果序號i標準工作液濃度iL各濃度標準工作液的平均相對光強度U標準曲線方程線性相關系數(shù)r相對光強度平均值1123x9126219673308833409532506415活性污泥的活性定量和測量重復性計算移取0L活性污泥懸液,加入L底物溶液,室溫反應5。將含有反應液的6孔板放入微孔板化學發(fā)光檢測儀中,測量反應液的相對光強度。步驟1至2重復6次,將6次測量的熒光示值的平均值作為樣品的平均相對發(fā)光強度,代入式)中,計算得到樣品P濃度的測量值。按式)計算樣品中活細胞濃度l)的范圍。按式)計算測量重復性,測量結果見表。9表20L活性污泥懸液的活性定量測量結果測量次數(shù)i123456i次測量的相對光強度RLU552117平均相對光強度RLU4濃度的測量值L5活細胞濃度lL-190測量重復性RSD0測量不確定度的計算生物降解試驗中法進行接種物活性的定量

測量結果的不確定的評定包括樣品體積V)引入的相對標準不確定V)和P濃度測量C)引入的相對標準不確定度)的評定,各分量的不確定度結果及評定方法見表。樣品體積V)引入的相對標準不確定度V)樣品制備引入的相對標準不確定度V)0L的活性污泥懸液制備過程中使用了2次0L的容量瓶0L的容量瓶使用次數(shù)為。兩種量程的容量瓶均為A級。由0L容量瓶定容引入的相對標準不確定度為:V3由0L容量瓶定容引入的相對標準不確定度為:V4則樣品制備引入的標準不確定度為:V=VV3測試樣品體積引入的相對標準不確定度V)測試溶液使用的移液器量程為,分度值為。校準證書中的擴展不確定度為:Uk)由移液器引入的標準不確定度為:kVULk相對標準不確定度為:VV4試驗過程中,溫度引入的不確定度可忽略不計。0則由樣品體積V)引入的相對標準不確定度為:V=VV3P濃度測量C)引入的相對標準不確定度C)標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度C)標準物質(zhì)純度為08 ,由標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確度為:C=80 3∑ni2i=1n標準曲線線性擬合引入的標準不確定度C最小二乘法擬合)∑ni2i=1n() ( )式中:

sy=

1i各濃度P標準溶液的相對光強度;根據(jù)標準曲線算出的理論值;標準溶液總共測量次數(shù)。標準曲線線性擬合標準不確定度C)為:C

1+1+ 0nn

)式中:

a p

1

j

20待測樣品濃度的平均值;p待測樣品溶液測定的次數(shù);標準溶液濃度的平均值;j標準溶液的濃度值。根據(jù)表2和表3中數(shù)據(jù),故計算得)C)。標準曲線線性擬合引入的不確定度為:C4樣品測量結果引入的相對標準不確定度C)11n11nyi2SD=

)式中:測量結果的標準偏差,;ii個測量的結果;n次測量結果的平均值;測量次數(shù)。1由測量重復性引入的標準不確定度為:npDn相對標準不確定度為:

C

3

p-- =根據(jù)表3中數(shù)據(jù),計算得C)。檢測儀器的測量不確定度C)

( ,由微孔板化學發(fā)光檢測儀校準證書得到擴展不確定度U3化學發(fā)光檢測儀的標準不確定度為:kuU5k測量儀器引入的相對標準不確定度為:Cu7因此,樣品中的濃度測量結果引入的相對標準不確定度為:

k=2

微孔板C=CC2綜上,由P濃度測量C)引入