超氧化物歧化酶活性測定

超氧化物歧化酶活性測定第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四一、意義：細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會傷害細(xì)胞。植物正常情況下植物逆境脅迫下O-.2、H2O2、OH·的產(chǎn)量增加；

SOD、CAT、POD活性降低；

VtE、VtC、CAR、GSH含量降低；

從而傷害細(xì)胞。植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡被打破第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四什么叫逆境？逆境是指對植物生存生長不利的各種環(huán)境因素的總稱.逆境的種類?第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四為什么要測定完全液和缺素苗的SOD活性？第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四二、目的要求：1.了解SOD活力測定的實(shí)踐意義；2.掌握SOD測定的原理及操作要點(diǎn)；3.比較完全液溶液和缺素溶液培養(yǎng)的玉米苗葉片SOD活性的差異。第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四三、原理：第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四三、原理：

依據(jù)SOD能抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2.-，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2.-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四四、儀器設(shè)備研缽；玻璃試管;40W熒光燈;移液管等。第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四五、試劑配制

1、提取介質(zhì)─50mmol/L(pH7.0)磷酸緩沖液。

2、反應(yīng)介質(zhì)─50mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液,內(nèi)含77.12μmol/L硝基四唑藍(lán),0.1mmol/LEDTA,13.37mmol/L蛋氨酸。3、80.2μmol/L核黃素溶液:

用含有0.1mmol/LEDTA的50mmol/L(pH7.8)的磷酸緩沖液配制。SOD反應(yīng)混合液3.9ml反應(yīng)介質(zhì)0.1ml80.2μmol/L核黃素溶液第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四六、植物材料:玉米葉片:

完全液培養(yǎng)苗缺素液培養(yǎng)苗第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四七、操作步驟將玉米葉片剪細(xì)─→混合均勻→稱0.2g(用保鮮膜包好放低溫冰箱預(yù)凍)→研磨成勻漿→再加入3ml緩沖液,研磨均勻后,將勻漿液倒入聚乙烯離心管中→低溫(0～4℃)下、4800rpm離心10min─→上清液即為酶液，將上清液倒入小青霉瓶，低溫下貯存，供SOD活性測定。

1、酶液的提?。杭尤?ml冰冷的0.05mol/LpH7.0磷酸緩沖液及少量的石英砂研缽第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四2.SOD活性測定：

取6支試管,編號,按下表加入試劑。將1號管用黑紙袋套上,與其它試管一起放熒光燈下,光強(qiáng)3000Lx照光10min,到時(shí)間后關(guān)燈,用黑布罩上試管(如室內(nèi)光線不強(qiáng),不罩黑布也可),以1號試管溶液為參比,測定樣品在560nm處的吸光度。不加酶的2號試管溶液顏色最深;加入酶的由于SOD抑制了硝基四唑藍(lán)的光還原,顏色變淺。

第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四2、活性測定：取6支干燥的、玻璃質(zhì)量一致的普通試管，按下表順序加入試劑試管編號123456參比對照管正常葉片缺素葉片酶液100μl100μl100μl100μl提取介質(zhì)(磷酸緩沖液)100μl100μlSOD反應(yīng)混合液(含核黃素)4ml4ml4ml4ml4ml4ml各管要充分搖均勻放暗處置于光強(qiáng)3000Lx照光10min560nm吸光值？第13頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四式中：Ack為2號對照管溶液在560nm處的吸光度值;

AE為樣品測定管溶液在560nm處的吸光值;

V為酶液總體積（ml)；

W為提取酶液的植物材料的鮮重（g)；

Vt為測定時(shí)酶液的用量(ml)。八、結(jié)果計(jì)算：（Ack-AE)×VSOD活性(U/g鮮重)＝───────────

Ack×W×Vt×50％

一個(gè)酶活單位定義為將硝基四唑藍(lán)的還原抑制到對照一半(50％)時(shí)所需的酶量。第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四

九、注意事項(xiàng):

1.所用試管的玻璃質(zhì)量要一樣。包括厚度、直徑、質(zhì)量等。2.照光條件要一致。照光時(shí)試管放的高度、背景等。3.要多做對照消除日光燈管的光質(zhì)差異。

4.植物組織中的酚類物質(zhì)對測定有干擾，對酚類含量高的材料提取酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。

5.結(jié)果計(jì)算時(shí)要用相鄰對照管代入公式計(jì)算。第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四十、思考題:

1.在SOD活性測定中為什么設(shè)照光和暗中兩個(gè)對照管。2.影響本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的主要因素是什么？應(yīng)如何克服？第17頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.下次實(shí)驗(yàn)：改良半葉法測定植物光合速率2.請按《植物生理生化實(shí)驗(yàn)B》補(bǔ)充材料認(rèn)真書寫預(yù)習(xí)報(bào)告！3.實(shí)驗(yàn)適宜時(shí)間：晴天上午8~9點(diǎn)開始。具體時(shí)間要看氣候，如果本周