臨床樣本的采集運輸和保存及核酸提取

臨床標本的采集、處理、運送與保存及DNA/RNA提取

研究背景樣本的采集、處理樣本的保存樣本的運輸DNA的提取RNA的提取研究背景一、樣本的采集、處理、保存及運輸臨床標本的正確采集、運送、保存

的重要性臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一（一）、樣本的采集地貧檢測樣品采集：外周血:≥5mL臍帶血:0.5~1mL羊水：20～30mL絨毛：≥15mg唾液組織標本采集的注意事項所有標本的采集、運送和處理應(yīng)在無菌操作，防止污染的原則下進行已采集標本都應(yīng)置于防漏、密封的無菌容器中運送采集足夠量標本每份標本都應(yīng)標記患者姓名、送檢號碼、標本來源、具體部位、日期、時間及相關(guān)臨床信息全血以全血作為待測標本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉，不可使用肝素全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存,如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA血清（漿）DNA測定，可按照一般的血清標本處理程序，對測定影響不大RNA測定，標本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴禁使用肝素)全血標本，抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標本，則需盡快(2小時內(nèi))分離血清，標本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃下

肝素的作用機理

肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上對標本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用每μg核酸標本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在標本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸在于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃下作用2小時可去除肝素的抑制作用（二）、樣本的運送

樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室樣本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄建議：將全血標本或DNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞運送。如需提取RNA的樣本需預(yù)處理后加lmlTrizol在低溫運送（三）、樣本的保存常規(guī)外周血標本，采集后做血常規(guī)，常溫24小時內(nèi)，4℃可保存1周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳4℃可保存15天；DNA提取樣本常溫24小時，4℃保存1個星期，－20℃保存3個月，－70℃保存半年～3年；RNA提取樣本常溫6小時，4℃保存12小時，－70℃保存3個月，羊水在12小時內(nèi)離心可保存同上。研究背景

二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗的正確與否臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)（一）、提取核酸總的原則

保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也應(yīng)盡量去除。（二）、核酸提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細胞釋放核酸機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機械法1.勻漿法機體軟組織2.搗碎法動物韌性組織3.研磨法細菌、酵母

Ⅱ物理法1.超聲法細胞混懸液2.反復(fù)凍融法培養(yǎng)細胞3.冷熱交替法細菌、病毒4.低滲裂解紅細胞

Ⅲ化學(xué)法1.有機溶劑細菌、酵母、血液2.去垢劑組織、培養(yǎng)細胞、血液3.酶解法細菌、酵母、血液2、核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌

4.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定濃度鑒定DNA：1）紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）RNA：紫外吸撇光光度勺法:A260×稀釋倍霉數(shù)×40踩＝糕μg/根ml(OD凡260船-OD峰320貍)×稀抓釋倍數(shù)乎×40野＝婦μ借g/m厚l2）熒光炕光度法熒光染衫料溴化肝乙錠，畢可嵌入予到堿基會平面，霜而發(fā)出忽熒光，判且熒光要強度與維核酸含再量呈正棉比。適用于弄低濃度妄核酸溶袖液的定蔥量分析創(chuàng)（1-沃5ng久）EB與D棋NA的結(jié)門合純度鑒端定紫外分額光光度域法：在260肢nm和2禾80nm細處測定D宅AN溶液賀的光吸收道，純的D標NAA260與A280之比應(yīng)晶在1.豬80(1.6虎0~1.直80)，低于此行值表明制暮備物中留帥有蛋白質(zhì)日成份。高謊于此值表掌明有RN已A的殘留罷量純的RN潮AA260與A280之比應(yīng)歐在2.糕0(1架.80~團2.00),搏Rati擊o<1.展8:墾蛋白質(zhì)污市染;R鍋atio棟>2.2以:R累NA可能隨已經(jīng)水解撫成單核苷圾酸A260槐/A28暴0比值是沙純度檢測蜓的重要指技標！注：測定吸光姿值，稀釋樸液應(yīng)使用煮ＴＥ完整性鑒屬定凝膠電可泳法：基因組D紫NA電泳屑，在電場監(jiān)中泳動慢表，如果發(fā)仁生降解，怨可出現(xiàn)電常泳圖譜脫期尾現(xiàn)象；總RN犧A電泳廉，觀測港各條帶乳的含量特，提示悄是否存肆在RN葉A降解完；如加蠟樣槽中冊存在條偉帶，可嬸能是D亞NA污頭染。DNA完腰整性鑒定劈燕：

正常時搜，28宏SR濟NA的勵熒光強站度約為梳18S簽RN漿A的2瘡倍，否墻則提示坐RNA揮的降解RNA章完整性灘鑒定：5、核夠酸的貯悶存——饅DNA父保存1）短淺期貯存丙：4℃或盤-20箱℃存放奔于TE第（tr是is和候EDT匠A）緩比沖液中潤。TE緩鍬沖液的興PH與膛DNA態(tài)貯存喜有關(guān)，練PH為哭8時，軋可減少連DNA躺脫氨反濾應(yīng)，P敞H低于評7.0寺時DN瓦A容易紡變性。2）長貿(mào)期貯存鼻：TE緩沖蠻液中-7產(chǎn)0℃保存廟數(shù)年；在秘DNA溶冷液中加一林滴氯仿可俘有效防止搬細菌和核督酸的污染吹。核酸的濕貯存—薄—RN笨A保存蠟：RNA可覽溶于0.嫁3mol電/L的醋酸刺鈉溶液港或雙蒸賞水，在顧-70題℃保存給。RNA可務(wù)溶于70展%的乙醇痛溶液或去哨離子的甲劑酰胺溶液乘中，可在鳳-20妙℃保存。RNA如窗果以DE碼PC（焦宜碳酸二乙驕酯）可以密抑制RN更A酶對R務(wù)NA的降配解三、基貢因組D周NA的籍分離與池純化（一）、唱DNA樣陵品準備常見的標帶本：血液、炊尿液、零唾液、椅組織及陷培養(yǎng)細嚼胞等生物組織饅：最好新鮮突組織，若濃不能馬上姻提取，應(yīng)罵貯存－7旨0℃或動液氮DNA徒提取前死樣本采震集、預(yù)兔處理和英保存：全血抗凝劑：EDTA蠶-Na2或枸櫞酸井鈉作為抗踢凝劑不宜使哀用肝素抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）、輔DNA提勒取（一）酚匆抽提法：先用ED質(zhì)TA、奴SDS突、蛋白酶墨K破碎細研胞，消化社蛋白，然廟后用pH8的Tr勾is飽唉和酚或困酚-氯騰仿抽提障DNA萬，最后請乙醇或桌異丙醇選進行沉閱淀。獲予DNA琴大小為激100志－15疲0kb銳。酚抽提法提取步驟：DNA海酚抽提質(zhì)法示意藍圖主要試劑塘的作用：EDT蔥A：1.體二價金健屬螯合殊劑，抑害制核酸冊酶；2.歡降低細伏胞膜的呼穩(wěn)定性SDS味的作用多：1.溶財解膜蛋白上和脂肪，煙從而使細爐胞膜破裂2.摟溶解核鍛膜和核笨小體，沿使其解恰聚，將膽核酸釋放出據(jù)來3.對套RNA、凍DNA酶船有抑制作夜用4.鉆與蛋白中質(zhì)形成尖R-O您-SO漲3…剛.R蛋臨白質(zhì)復(fù)授合物，寇使蛋白征質(zhì)變性蛋白酶K駛：水解蛋壩白質(zhì)的背作用，粉消化D皮NA酶防和細胞逆中的蛋裁白質(zhì)蛋白酶返K與其乏他蛋白抹酶相比稠，它具卷有更強叛的水解抄能力，而且款在SDS休、EDT磨A存在時謠仍保持較梁高活性，趴可同時使用苯酚：蛋白質(zhì)強餃變性劑、矮抑制DN博A酶活性苯酚溶鋸于有機佳溶劑，度微溶于謊水提取D難NA前蚊苯酚用圣Tri豆s-H影cl飽劉和，防柱止吸收姓過多D肆NA，錄降低D燭NA的激損失率氧化苯酚砌會破壞D質(zhì)NADNA的音沉淀：1）無陸水乙醇已沉淀沉淀前往遞往加入N腦aCl等俗鹽離子，稀作用是中投和核酸分拉子表面的個負電荷，嫁有助于分灑子之間的源聚集。無水乙醇彎可以吸收灣分子之間鼠的水，使貌DNA沉毅淀析出，朵無水乙醇蘇使用前冰課凍，可以屬減少DN械A(chǔ)沉淀析或出過程釋鞠放熱量對識DNA的頁損傷。2）異級丙醇沉突淀除了使D蝴NA沉淀膛外，還可難以溶解少參量的小的充RNA分烈子（二）側(cè)甲酰已胺解聚逝法：破碎細胞徹同上，然魂后用高濃膠度甲酰胺輔解聚蛋白外質(zhì)與DN也A的結(jié)合液，再透析歡獲得DN新A。高濃共度甲酰胺赴可以裂解丘蛋白質(zhì)與陵DNA的棋復(fù)合物，橡可以使蛋展白質(zhì)變性傳。減少了芽酚多次抽查提的步驟甲酰胺解障聚法適用統(tǒng)于從標本鑒中制備高薯分子量的丙DNA樣酸品?？傻脛?chuàng)DNA選200k賭b左右。（三）鄭磁珠法規(guī)：磁珠在高蘿鹽低pH腹值下吸附歇核酸，在葡低鹽高p顛H值下與烤核酸分離職，再通過歐移動磁珠捧來獲取D拆NA（四）微倡柱法：利用D撐NA在蛾高鹽、宏低pH賓的特定謠溶液環(huán)劃境下可鋼吸附在貪固相介閥質(zhì)（如薦硅膠膜蝕）上，催洗滌去雜除雜質(zhì)訴后，再永改變?nèi)芎Ｒ涵h(huán)境烘使DN斗A溶解胡到純水混或TE賊中（三）祝、DN只A的濃恒縮固體聚俗乙二醇鏡（PE制G）濃鏡縮：用底透析袋軟外丘敷PE姻G至合配適量丁醇抽糞提濃縮掘：DN另A溶液較中水可囑分配到碧正丁醇件或仲丁悟醇，但競DNA君不會。器因此重匹復(fù)幾次蜂可顯著玻減少D格NA體師積（四）箭、DN牽A回收主要是從五電泳中分器離回收D蠶NA片段回收原悼則：盡逢量提高祥回收率去除回鼻收DN齊A樣品喂中的污捐染物DNA蜜降解的傳原因樣本不甲夠新鮮四，采集搬材料過演陳舊樣本本身雖存在大量椅DNA酶提取DN浩A的生物肆活性差的援原因？提取的基譜因組DN叛A鹽濃度鞋過高基因組桃DNA胸中乙醇衫未清除巡壽凈基因組D芹NA中可閥能存在其著他抑制因該素提取基因灶組DNA反，有時加邀入蔗糖的漁原因加入多糖頂，保護D帖NA長度影響DN燥A質(zhì)量的桿因素四、R帶NA的位分離與零純化（一）仍、樣本計來源理論上侍所有有榨核真核畝細胞、將細菌、槽病毒都王可以提棋取RN扔A樣本選開擇取決義于試驗旗目的全血是基味因組提取限RNA最氣常見的樣摸本每個細級胞的R下NA量觀約為1臺0-5μg80%-焰85%剖r朗RNA10%-喊15%巡壽t技RNA1%-車5%河mR喊NA其他RN教A：hn來RNA、袍snR銅NA、彈snoR裁NA…組織材料起始樣品量TotalRNA提取量blood1ml15~20μgleukocytes1×107個約100μgLivertissue1g約5000μgCulturecells1×107個約100μgRenaltissue1g約3000μgSkeletontissue1g約1500μgCerebraltissue1g約1500μg（二）表、RNA提擋取的獨特惰性—關(guān)于R舍Nase掠酶臨床標本添及實驗室浮環(huán)境中,限存在大量五對RNA奴具有強烈瞞降解作用逗的RNa僚se，而衡RNas旗e較耐高說溫,不易南失活如何避捷免RN西ase具對標本阿的污染桿及防止密RNa家se對雁提取的吹RNA胖的降解敢,是保纖證RN蓬A(yù)成功雨提取的燥關(guān)鍵之統(tǒng)所在RNas爸e酶RNA易催被RNa吉se水解男，RNa闊se除胞躲內(nèi)還廣泛貴存在于人斗的皮膚、告唾液、汗起液及周圍奪的環(huán)境中RNa敢se具盆有水解顛核糖殘績基和磷寒酸二酯狠鍵RNas陣e分子結(jié)霸構(gòu)中的二棄硫鍵使其甩生物學(xué)活未性非常穩(wěn)狂定，去除注變性劑后枝，RNa旺se的活球性又可恢喚復(fù)去除R灘Nas衰e的污男染及強矛有力地之抑制其印活性是分RNA仙制備成園功與否真的關(guān)鍵必須在總淋RNA提掃取分離的最初階闖段，盡可能儀地滅活胞制內(nèi)RNa處se的活斬性1.尤內(nèi)源性鋪RNA沒酶（i糖ntr杜ins蹲ic蠶RNa儀se）2.外俊源性RN善A酶(e獸xtri尾nsic米RNa夢se)主要來旱源：被污染的駝緩沖液細菌或微受生物污染怎，高壓不柜能去除R話NA酶自動移液曬裝置3.朽實驗室泳采取避雨免RN共A酶污剪染的措杠施設(shè)置專門宏RNA移屬液裝置小份保存孫緩沖液設(shè)置專門默的RNA艷電泳裝置準備溶液池或緩沖液喜時，使用蠟無RNA閘酶的器皿紡、DEP寨C處理等水等分離RN跌A過程中圈使用RN谷A酶抑制哄劑4.R墳NA酶的群去除DEP死C（焦渠碳酸二股乙酯）高度活化摧的烷基化身試劑，破盞壞RNA肥酶活性。雀用來滅活減緩沖液或?qū)て髅笾械尿TRNA酶勸。OC-CH2-CH3OC-C撞H2-CH3O==DEPC像水制備：霧0.1%短DEPC胖在37°C處理1剛h，并遍高壓滅邪菌15渾min著。玻璃制粉品和塑灰料制品僑應(yīng)浸泡竹在0.率1%的潑DEP盛C水溶云液中，殖37°C處理1h籠或室溫下篩過夜。DEP就C非選嶼擇性的少修飾蛋奏白質(zhì)和區(qū)RNA媽，且與員一些緩窯沖液不捐相容，它故在分具離和純央化RN咱A的過豈程中不視使用D圈EPC5.R鞭NA提取叛所用器皿赴的處理經(jīng)高壓科滅菌的訴一次性威使用的蘋塑料制孕品如試挪管,離筍心管等耗基本上胸?zé)oRN歇ase學(xué),可以償不經(jīng)預(yù)啦處理直櫻接用于良制備和縣貯存R燥NA實驗室用屢的普通玻緞璃器皿經(jīng)折常有RN益ase污劣染,使用病前必須于梅180℃巨干烤8小舞時以上,筍或用0.挺1%焦碳需酸二乙酯屑(DEP純C)的水幅溶液浸泡家用于制備些RNA的悟燒杯,試斑管和其它尾用品DEPC法是RNa班se的強廳烈抑制劑殖。灌滿D搏EPC的船器皿于3嗎7℃下放蜓置2小時宣，然后用棋滅菌水淋杠洗數(shù)次，烈并于10鵝0℃干烤號15分鐘臺，最后高隔壓蒸汽下竄15分鐘忍。上述處惹理可除去篩器皿上痕滔量的DE劃PC,以擋防DEP梨C通過羧蹦甲基化作恭用對RN豆A的嘌呤智堿基進行蜻修飾6.睛RNA饞提取所耕用溶液脫的準備對于RN化A提取所憑需溶液的睜配制,必筐須用高壓廁滅菌的水釋和RNA葬研究專用里的化學(xué)試諷劑配制溶座液,用干礙烤過的藥仗匙稱取試封劑,將溶液液裝入無董RNas雅e的玻璃峰器皿?？煞四艿脑?應(yīng)溶液均應(yīng)葛用0.1耽%DEP波C于37禿℃至少處磨理12小瘋時,然后蟻于100像℃加熱1自5分鐘或雙高壓蒸汽譯滅菌15甘分鐘須注意爺?shù)氖?盈DEP隙C可與租胺類迅束速發(fā)生悔化學(xué)反資應(yīng),因獲此不能日用來處豈理含有翠Tri藝s一類叔的緩沖需液,因仆此可存陡幾瓶新然的,未疾開封的姐Tri米s試劑剖以制備充無RN澆ase涉的溶液7.誦RNA棕提取中缸RNa嫁se獨污染的濟控制實驗操己作人員涼的手是社RNa咸se污副染最主倚要的潛翅在來源達。策略是：在準備用于民RNA純當化的實驗燈材料和溶暖液時,以爐及在涉及鹽RNA的腹整個提取棄操作過程耳中,都應(yīng)票戴一次性燈手套在RNA提改取實驗中尿，應(yīng)勤換柜手套（三）、凳用于提取峰RNA的尊血樣的處耐理取新鮮恒抗凝血尚2－3泳ml入揪15m疾l無菌悅塑料管側(cè)，60哭0g離闖心5分坑鐘，棄霉上清。加入6妨倍細胞軟體積的騙紅細胞辛裂解液雄（約1拖2ml領(lǐng)），輕悄輕吹打各混勻，或本步驟區(qū)在室溫荒或4度遵操作均潑可。裂低解時間案至4-筑5分鐘獄，并且竟裂解過醒程中宜蛋適當偶觸爾搖動蜂以促進可紅細胞誦裂解。600賞g離心憐5分鐘壺，棄紅岡色上清稅。4℃贈離心效惠果更佳針。一般情況碌下，裂均解1次紅初細胞應(yīng)該側(cè)裂解的差嬌不多，如狀果有較多鄙紅細胞沒假有裂解的妙話，可以停再加點紅且細胞裂解做液約5m數(shù)l裂解1言次。步驟辰同3。向得到收的細胞媽團中加擊Tri厲zol愈1.囑0ml艷，彈勻滔，將細趨胞團打橡散，轉(zhuǎn)脹入1.等5ml蛙無菌塑咬料管，耗封好蓋魄。標上瓶號，纏覆上封口喬膜，－伶20℃或－7鞏0℃保存。（四）、羅RNA提獻取的常用欄方法表面活性閥劑加蛋白疫酶K，氯芬仿-酚抽蠶提法胍鹽提取品結(jié)合氯仿英-酚抽提翠法胍鹽提取串結(jié)合玻璃嚴粉、二氧侮化硅等顆群粒懸浮吸浮附法等RNA心提取實晚驗前的輪準備【使用器證具】盡量使唯用一次束性塑料睡器皿，繼若使用糖玻璃器排皿，則統(tǒng)使用0棄.1%油DEP奸C水溶谷液在3照7℃處候理12略h，后靜120姐℃高壓覆30m寄in，做去除殘護留DE垂PC【試劑配奔制】無菌水盡須用0囑.1%給DEP撕C處理駝后高溫準高壓滅振菌RNA渴實驗試容劑應(yīng)R棄NA提述取專用犧，避免剝其他試抓劑交叉欠污染【其他】實驗過程詞中使用一禾次性手套紗，并經(jīng)?；⒏鼡Q；在豈RNA專霧用區(qū)操作宣，操作過先程中避免裹交談…啊…表面活討性劑加零蛋白酶術(shù)K，氯斑仿-酚舒抽提法旅：每mg組柏織中加入犬1mlT終rizo乎l試劑，祝高速破碎鳥組織（