文檔黑膠蟲污染

細胞培養(yǎng)中的黑膠蟲污染及解決方案點擊次數(shù)：2365發(fā)布時間：2011-4-2細胞培養(yǎng)中的黑膠蟲污染

摘要：預防和避免污染是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，黑膠蟲(也稱黑焦蟲)是近幾年來幾乎出現(xiàn)在每個細胞培養(yǎng)實驗室。但是現(xiàn)在無法對黑膠蟲的確認和鑒別，導致學術(shù)界說法不一，筆者收集了關(guān)于黑膠蟲的資料，對黑膠蟲進行類系統(tǒng)描述，對黑膠蟲出現(xiàn)的情況對細胞培養(yǎng)的影響以及黑膠蟲污染后的有效處理進行介紹。

關(guān)鍵詞：黑膠蟲污染處理細胞培養(yǎng)

Thepollutionofblackdotsincellculture

(Grade2005,Biotechnology,SchoolofLifeScienceandEngineering)

AbstractPollutionpreventionisthekeytosuccessincellculture,blackdots(alsocalledblackparticles)almostappearedineverycellculturelaboratoryinpastfewyears.Butnownooneabletoconfirmandidentifywhattheblackdotsis.Thisleadtoappeardifferentacademicarguments.Theauthorcollectedinformationabouttheblackdotstomakeadescriptionaboutblackspotswhichsimilartothesystemicdescription,andIntroducewhenaandwheretheblackdotscomeout.Atthesametimegivesomeadvicetodealwiththeblackdots.

KeywordsPollutionblackdotscellculture

前言

污染是細胞培養(yǎng)的大敵。預防和避免污染是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。

細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染。他們在細胞培養(yǎng)中污染的特點如下：

1、細菌：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。

2、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染，國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是慢慢死去。

3、黑膠蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

4、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。

5、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。

6.病毒：組織細胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題

7、非同種細胞污染：即是細胞交叉污染，由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質(zhì)所致。

在上述的八種污染物中，黑膠蟲是現(xiàn)代細胞培養(yǎng)中討論比較多的，但大多數(shù)文獻未對其進行描述或一帶而過，就像上面關(guān)于描述黑膠蟲的情況是不完整，還有很多不明的情況。對其身份有多種猜測，到現(xiàn)在都沒有權(quán)威地對黑膠蟲進行分類學上的歸類。黑膠蟲到底是不是一種生物，如果是那黑膠蟲會是何種生物，如果不是，那黑膠蟲會是什么？一系列的問題都懸在奮斗在細胞生物學領(lǐng)域的學者們的心中。

1關(guān)于黑膠蟲的描述

1.1分類上的描述

對于黑膠蟲的分類，學術(shù)界沒有明確給予說法。關(guān)于黑膠蟲的分類，目前大部分人認為黑膠蟲污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型，但是沒把它歸為確定的生物分類類型，只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物。而根據(jù)中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，但是由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)下去，最終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲。也有一些學者不認為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染，而認為是細胞碎片類物質(zhì)，是在細胞培養(yǎng)時，細胞衰亡破裂產(chǎn)生的；也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質(zhì)，那個文獻很少人找得到；還有報道黒膠蟲是一種納米級的細菌。

1.2形態(tài)上的描述

形態(tài)上類似與桿狀細菌，但長度比細菌長，直徑約在0.5~1微米，不染色觀察為黑色；膠蟲成熟后呈線狀，而且形態(tài)是橢圓形。

1.3運動形式

在400X倒置顯微鏡小，有典型的布朗運動(不規(guī)則的原地小距離抖動)，即很多細胞培養(yǎng)者看到的，像黑色的小蟲游來游去?？梢源┩笧V膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學上來說，顆粒足夠小，在液體中也是做布朗運動的，這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物。

1.4生理上的描述

1.4.1抗性

2.2.2真菌

有很多人發(fā)現(xiàn)類似黑膠蟲的，但最后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明黑膠蟲不存在只是細胞培養(yǎng)中的真菌感染，還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物。如果黑膠蟲是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關(guān)注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“黑膠蟲”是真菌的細胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了，要進行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導致培養(yǎng)失敗，所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能。

2.2.3寄生類原蟲

黑膠蟲屬于寄生類的原蟲，而不是細菌、支原體，也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態(tài)，一種較大，運動較慢，泛紅光；另一種較小，運動較快，紅中帶綠，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗，單純培養(yǎng)過污染膠蟲的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲。給人的感覺是膠蟲和細胞一樣有叢集性，如果膠蟲密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生，細胞受感染的程度也大，這時除了培養(yǎng)基中可見外，細胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長。據(jù)說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)進行下去。由此黑膠蟲屬于原蟲的有比較大的可能性。

3關(guān)于黑膠蟲出現(xiàn)的幾種情況

1.“黑膠蟲”的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態(tài)不佳時顯現(xiàn)并使實驗中斷，尤其在凍存細胞復蘇時可造成大量細胞死亡。就是在細胞生長狀態(tài)不良時，黑膠蟲容易出現(xiàn)?！昂谀z蟲”生長與細胞的生長有此消彼長的關(guān)系，即當細胞狀態(tài)好時小黑點會相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細胞競爭生長的關(guān)系，但總的來說它的出現(xiàn)似乎并不影響細胞的生長。

2.細胞剛用的時候，觀察均生長良好，密度適中，培養(yǎng)液清亮，小黑點一般不出現(xiàn)，但是對細胞傳代以后就陸續(xù)出現(xiàn)多少不等的小黑點，有時候在一夜之間暴長。細胞進過多次傳代的情況下，也會使黑膠蟲出現(xiàn)。

3.換用了其他公司的血清，多是北方公司的血清，就出現(xiàn)了這種非常類似這里的”黑膠蟲“的情況。在北京醫(yī)科大學/中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社出版的《現(xiàn)代實驗血液學研究方法與技術(shù)》書中關(guān)于檢查血清中寫道，“我國北方小牛血清還多見黑膠蟲污染”。其實在很多，遭遇黑膠蟲的案例中，大部分細胞培養(yǎng)者都認為黑膠蟲來源于血清。

4關(guān)于再細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑膠蟲后的幾種處理建議

1．換好一點的血清，當然最好是進口胎牛血清(國產(chǎn)血清太臟)，就是價格高的離譜，經(jīng)濟條件不允許，可以用進口新生牛血清代替。建議如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必滅活，這樣可以有效減少“小黑點”的形成。一般的血清都不要去滅活處理，為什么呢？INVITROGEN公司在其血清說明書上解析道：經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱滅活的血清，沉淀物的形成會顯著增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。除非是在做免疫學研究或培養(yǎng)干細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，才推薦做熱滅活。所以在不是做免疫學研究或培養(yǎng)干細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞培養(yǎng)時，血清盡量不經(jīng)熱滅活。

2．如果是貼壁細胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，就不太好處理拉，可以向其中少加一點滋養(yǎng)細胞。加滋養(yǎng)細胞對有黑膠蟲的剛復蘇的細胞很有效！還有就是實驗環(huán)境要注意好，保持細胞間整個環(huán)境的潔凈度。如果細胞不是非常珍貴，可以用伯氨奎、磺胺、四環(huán)素、貝尼爾，也有建議慶大霉素500ug/ml洗滌。

3．換用進口的一次性塑料培養(yǎng)瓶。

4．停止復蘇，停止養(yǎng)細胞，徹底消毒所有用于細胞培養(yǎng)的一切用品，包括所用的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基，吸管，胰酶，孵箱，超凈臺、空間等等你能想到的和細胞培養(yǎng)相關(guān)的所有物品。一個星期后，再復蘇污染之前凍存的細胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。這樣你可能覺得動作太大，但可以用一個星期的時間挽救兩個月的時間，還有其他你為了找到污染源，去除污染所耗費的精力，和財力。

5．在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入培養(yǎng)液，堅持天天洗，傳代時加生理鹽水再離心一次，接種密度稍大一些，一段時間后，蟲子就會大大減少，對細胞的生長也不會有大的影響。

所有東西最好重配；如果實在要搶救，重點突破，留幾瓶污染不是很嚴重的細胞搶救，其余棄去

6．如果有其它可用的細胞，那么污染的細胞最好扔掉；如沒有，可試著用抗生素，最可靠的是細菌培養(yǎng)加藥敏，據(jù)藥敏結(jié)果選擇抗生素，當然不能影響到細胞的狀態(tài)。

7．有材料稱minocycline具有一定的作用，可以和換液結(jié)合起來使用。

由于黑膠蟲尚未明確鑒定出是什么生物，所以上述的處理方法不一定正確，可以供考慮采用。

8.有人為尋找到殺滅“黑膠蟲”的方法，做了一個試驗，他取有“黑膠蟲”污染的六孔板，每孔內(nèi)有2ml培養(yǎng)液，向有污染的孔內(nèi)分別加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新潔爾滅原液，邊加邊在倒置顯微鏡下觀察。最后他得出結(jié)論：新潔爾滅與水或培養(yǎng)基的比例為1：4時即可殺死“黑膠蟲”。但是新潔爾滅對細胞的負面影響太大，比較珍貴的細胞培養(yǎng)最好不采用此方法。

5.國外關(guān)于黑膠蟲的相關(guān)情況

在國外的生物論壇上也有很多人在討論blackdots和blackparticles，也就是我們所說的黑膠蟲。他們所描述blackdots和blackparticles的情況，基本上和國內(nèi)論壇上相似。國外有人用實驗證明blackdots或blackparticles不是支原體，而在細菌范圍內(nèi)?；具^程如下：Iftheposterisconcernedaboutmycoplasma,thereareteststoidentifythem.OneisaHoechstdyestainingtechniquetolookforextranuclearDNAspots.Also,prepare