種子的擴大培養(yǎng)

發(fā)酵過程控制技術(shù)|食品生物技術(shù)/藥品生物技術(shù)|

陳珊時間：2021.5種子的擴大培養(yǎng)工業(yè)菌種介紹除常見的四大類典型微生物外，還有病毒，藻類，以及蕈菌類微生物。菌種選育方法自然界篩選，人工誘變，原生質(zhì)體融合，基因工程技術(shù)，蛋白質(zhì)工程等種子擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的和流程，種子擴大培養(yǎng)的質(zhì)量影響因素影響種子擴培因素包含的數(shù)量，質(zhì)量等要求種子的擴大培養(yǎng)教程地位教學(xué)目標學(xué)情分析教學(xué)重點種子的擴大培養(yǎng)一、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。種子的擴大培養(yǎng)種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體

活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長

無雜菌污染種子的擴大培養(yǎng)1.種子擴大培養(yǎng)的一般流程保藏菌種斜面活化一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)…

發(fā)酵罐種子罐級數(shù)的確定2.種子擴大培養(yǎng)過程大致可分為兩個階段：實驗室種子制備孢子制備液體種子制備好氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)生產(chǎn)車間種子制備種子罐的作用種子罐級數(shù)的確定確定種子罐級數(shù)注意點實驗室種子的制備

實驗室種子的制備一般采用兩種方式：對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。種子的擴大培養(yǎng)1，細菌孢子的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37℃。細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1-2天，產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要5-10天。2，霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25-28℃。培養(yǎng)時間一般為4-14天。3，放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28℃。培養(yǎng)時間為5~14天。（一）孢子的制備種子的擴大培養(yǎng)1，好氧培養(yǎng)對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備種子的擴大培養(yǎng)1，好氧培養(yǎng)對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備種子的擴大培養(yǎng)2，厭氧培養(yǎng)對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡氏罐→種子罐例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制：3克麥芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克瓊脂與升水中）的斜面上，于4℃冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2-3天后，再擴大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2天后，移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20℃培養(yǎng)3-5天即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。種子的擴大培養(yǎng)生產(chǎn)車間種子的制備

實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。1，種子罐的作用：主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。種子的擴大培養(yǎng)2，種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（1）菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。比如：細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27℃,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27℃，10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子種子的擴大培養(yǎng)3，確定種子罐級數(shù)需注意的問題（1）種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會（2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會（3）雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。種子的擴大培養(yǎng)三、種子質(zhì)量檢查與影響種子質(zhì)量的因素1.種子質(zhì)量檢查菌體量與菌體形態(tài)pH與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的變化產(chǎn)物生成量酶活力種子液的外觀與氣味2.種子質(zhì)量控制Ⅰ、影響孢子質(zhì)量的因素及控制

Ⅱ、影響種子質(zhì)量的因素及控制3.種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢；菌絲結(jié)團；菌絲粘壁種子的擴大培養(yǎng)

1，培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。

例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動，起主要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。Ⅰ、影響孢子質(zhì)量的因素及控制

影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和冷藏時間等。種子的擴大培養(yǎng)

水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用；（2）嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定時間；（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源。種子的擴大培養(yǎng)2，培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。

如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37℃培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。

例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。相對濕度（%）斜面外觀活孢子計數(shù)（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黃上部薄、中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.7不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響

（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。種子的擴大培養(yǎng)3，培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7-8天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。種子的擴大培養(yǎng)4，接種量種子的擴大培養(yǎng)

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積

過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響楊博，中國油脂，2002采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產(chǎn)量。種子的擴大培養(yǎng)Ⅱ、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。1，培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：（1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要（2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；（3）營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；（4）營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高（5）營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。

2，培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。種子的擴大培養(yǎng)

3，種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。

種子的擴大培養(yǎng)4，接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有時20-25%。種子的擴大培養(yǎng)Ⅲ、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過程中通常進行以下兩項檢查。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查（2）無（雜菌）檢查

種子的擴大培養(yǎng)四、種子制備過程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵(1)、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5，瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次種子的擴大培養(yǎng)(2).一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml，32℃培養(yǎng)12h。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近