(課件)-B型DNA僅僅是眾多DNA雙螺旋構(gòu)象中的一種在外界條件

(課件)-B型DNA僅僅是眾多DNA雙螺旋構(gòu)象中的一種。在外界條件第一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第1頁(yè)，共60頁(yè)。模型中的堿基配對(duì)有何重要性？①A-T,G-C配對(duì)可形成很好的線性氫鍵；②A-T對(duì)和G-C對(duì)的幾何形狀一樣，使雙鏈距離相近，使雙螺旋保持均一；③堿基對(duì)處在同一平面內(nèi)。不論核苷酸的順序如何，都不影響雙螺旋的結(jié)構(gòu)；④為DNA半保留復(fù)制奠定了基礎(chǔ)。

第二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第2頁(yè)，共60頁(yè)。

螺旋槳效應(yīng)第三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第3頁(yè)，共60頁(yè)。第三節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)一．DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素(1)堿基對(duì)之間的氫鍵。(2)堿基的堆集力。它包括：①疏水作用；②范德華力；③磷酸基的負(fù)電荷斥力；第四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第4頁(yè)，共60頁(yè)。堿基配對(duì)及氫鍵形成第五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第5頁(yè)，共60頁(yè)。第六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第6頁(yè)，共60頁(yè)。腺苷(AR)脫氧胞苷(dCR)β1’,N9-糖苷鍵

β1’,N1-糖苷鍵β1’β1’N9N1C2C4第七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第7頁(yè)，共60頁(yè)。二.雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變異DNA的構(gòu)象現(xiàn)已知有A，B，C，D，E，T，Z7種。引起DNA雙鏈構(gòu)象改變有以下因素：（1）核苷酸順序；（2）堿基組成；（3）鹽的種類(lèi)；（4）相對(duì)濕度。第八頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第8頁(yè)，共60頁(yè)。第九頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第9頁(yè)，共60頁(yè)。Z-DNA的發(fā)現(xiàn)：1972年

Pohl

etal發(fā)現(xiàn)poly(dG-dC)在高鹽下旋光性發(fā)生改變；1979年

WangA.H-J(王惠君),A.Rich對(duì)d(CGCGCG)單晶作X衍射分析提出Z－DNA模型第十頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第10頁(yè)，共60頁(yè)。三左旋DNA（一）Z-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。(3)G的糖苷鍵呈順式(Syn)，使G殘基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。(5)大溝消失，小溝窄而深。(6)每個(gè)螺旋有12bp。第十一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第11頁(yè)，共60頁(yè)。目前已知DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)可分為A、B、C、D及Z型等數(shù)種，除Z型為左手雙螺旋外，其余均為右手雙螺旋。

Z-DNA B-DNA

第十二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第12頁(yè)，共60頁(yè)。第十三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第13頁(yè)，共60頁(yè)。生化專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)委員會(huì)

建議用俯視圖(N9→C1’)=0°±90°時(shí)為順式(syn)=180°±90°時(shí)為反式(anti)嘌呤核苷的扭轉(zhuǎn)角為X(C4,N9，C1’,0)；嘧啶核苷的扭轉(zhuǎn)角為X(C2,N1，C1’,0)。習(xí)慣用法是：X=–60°~0°~120°為順式；X=120°~180°

~–60°為反式；-60°-60°0°

90°0°120°-90°180°90°120°180°-90°嘌呤C4嘧啶C2順式反式第十四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第14頁(yè)，共60頁(yè)。核苷的順?lè)礃?gòu)象第十五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第15頁(yè)，共60頁(yè)。第十六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第16頁(yè)，共60頁(yè)。第十七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第17頁(yè)，共60頁(yè)。Z－DNA存在的條件：

(1)高鹽：NaCl>2Mol/L,MgCl2>0.7

Mol/L(2)Pu,Py相間排列：（3）在活細(xì)胞中如果m5C,則無(wú)需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下可產(chǎn)生Z型。(4)在體內(nèi)多胺化合物，如精胺和亞胺及亞精胺和陽(yáng)離子一樣，可和磷酸基因結(jié)合，使B-DNA轉(zhuǎn)變成Z-DNA。(5)某些蛋白質(zhì)如Z-DNA結(jié)合蛋白帶有正電荷，可使DNA周?chē)纬删植康母啕}濃度和微環(huán)境。(6)負(fù)超螺旋的存在第十八頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第18頁(yè)，共60頁(yè)。(三)生物學(xué)意義(1)可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識(shí)別。嚙齒類(lèi)動(dòng)物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；(2)在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)，它有大、小兩個(gè)核，大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核和繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說(shuō)明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄有關(guān)。第十九頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第19頁(yè)，共60頁(yè)。第二十頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第20頁(yè)，共60頁(yè)。四、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)所謂DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)，是指在一二結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的多聚核苷酸鏈上的卷曲。在一定意義上，是指雙螺旋基礎(chǔ)上的卷曲三級(jí)結(jié)構(gòu)包括鏈的扭結(jié)和超螺旋或者是單鏈形成的環(huán)或是環(huán)狀DNA中的連環(huán)體第二十一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第21頁(yè)，共60頁(yè)。超螺旋（Supercoied）

松馳型DNA（relaxform）。超螺旋（Supercoied）DNA，

負(fù)超螺旋正超螺旋檢測(cè)DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法：密度梯度離心凝膠電泳電鏡觀察第二十二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第22頁(yè)，共60頁(yè)。（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)第二十三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第23頁(yè)，共60頁(yè)。原核生物DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)：絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進(jìn)一步盤(pán)繞則形成麻花狀的超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)。

第二十四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第24頁(yè)，共60頁(yè)。超螺旋的定量描敘White方程：L=T+WL（Linkingnnmber）：鏈環(huán)數(shù)或稱(chēng)拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)，指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是(1)L是整數(shù)；(2)在cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；(3)右手螺旋對(duì)L取正值。第二十五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第25頁(yè)，共60頁(yè)。W（Writhingnumber）：扭曲數(shù)，即超數(shù)旋數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。第二十六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第26頁(yè)，共60頁(yè)。T（Twistingnumber）：纏繞數(shù)，即雙螺旋的圈數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手螺旋時(shí)T為正值。超螺旋的量度可以用超螺旋密度λ來(lái)表示：

λ=（L-T）/T在天然DNA中，λ約為-0.05第二十七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第27頁(yè)，共60頁(yè)。（二）三鏈和四鏈DNA這些DNA分子的結(jié)構(gòu)單元分別是三堿基體和四堿基體；這些堿基體通過(guò)Watson-Crick氫鍵配對(duì)和Hoogsteen氫鍵配對(duì)相互作用而結(jié)合成共平面聚合體：Watson-Crick－HoogsteenWatson-Crick－reversedHoogsteenReversedWatson-Crick－HoogsteenReversedWatson-Crick－reversedHoogsteen第二十八頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第28頁(yè)，共60頁(yè)。三鏈DNA基本結(jié)構(gòu)：Py-Pu-Py構(gòu)象(如T-A.T,C-G.C+)Pu-Pu-Py構(gòu)象(如A.A-T,G.G-C)

第二十九頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第29頁(yè)，共60頁(yè)。H|DNA第三十頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第30頁(yè)，共60頁(yè)。第三十一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第31頁(yè)，共60頁(yè)。第三十二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第32頁(yè)，共60頁(yè)。第三十三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第33頁(yè)，共60頁(yè)。鳥(niǎo)嘌呤四聚體第三十四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第34頁(yè)，共60頁(yè)。第三十五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第35頁(yè)，共60頁(yè)。第四節(jié)DNA的變性與復(fù)性變性（denaturation）或解鏈（melting〕復(fù)性（renaturation）或退火（annealing）成核作用（nucleation）拉拉鏈作用（Zippering）DNA的復(fù)性對(duì)片段有兩個(gè)要求：(1)互補(bǔ)順序的碰撞和排列；(2)堿基的正確配對(duì)和氫鍵的形成。第三十六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第36頁(yè)，共60頁(yè)。下列因素可導(dǎo)致DNA變性：高溫、酸、堿、尿素、甲酰胺DNA變性后物理性質(zhì)發(fā)生的變化：（1）流體力學(xué)的性質(zhì)發(fā)生改變：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了對(duì)紫外線的吸收能力，此稱(chēng)為

增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。第三十七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第37頁(yè)，共60頁(yè)。雙鏈DNA的A260=1.00（濃度為50μg/ml時(shí)，對(duì)波長(zhǎng)260nm紫外線的吸收能力）；單鏈DNA的A260=1.37；游離堿基或核苷酸的A260=1.60。解鏈溫度（meltingtemperature,Tm）或熔點(diǎn)，Tm是A260的升高達(dá)到極大值一半時(shí)的溫度。即是變性溫度范圍的中點(diǎn)。影響變性的因素：

外部條件如溫度和正離子的濃度。濃度低于0.4mol/L，單價(jià)陽(yáng)離子增高10倍，Tm增加16.6°第三十八頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第38頁(yè)，共60頁(yè)。

內(nèi)部條件

GC含量及分子類(lèi)型當(dāng)GC的含量上升1%，則Tm上升0.4℃

馬默多蒂（Marmur-Doty）關(guān)系式：

Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）×2.44第三十九頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第39頁(yè)，共60頁(yè)。復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式

C11C021+KC0t1/2

根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式我們可以知到些什么？復(fù)性進(jìn)行一半時(shí)==第四十頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第40頁(yè)，共60頁(yè)。(1)單鏈濃度隨著時(shí)間的增大而減小；(2）反應(yīng)速率取決于初始的單鏈濃度Co；(3)以反應(yīng)濃度和COt1/2為座標(biāo)可繪復(fù)性曲線；(4)通過(guò)COt1/2值可測(cè)原核生物基因組的大小；

已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp,COt1/2=9M.SecCOt1/2（任何基因組DNA）/9M.sec=任何基因組大小/4.2X106bp(5)原核生物基因組大小不同，復(fù)性曲線也不同；(6)可用以區(qū)分真核生物和原核生物基因組。第四十一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第41頁(yè)，共60頁(yè)。第四十二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第42頁(yè)，共60頁(yè)。第四十三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第43頁(yè)，共60頁(yè)。第四十四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第44頁(yè)，共60頁(yè)。單一順序和重復(fù)順序

復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線的區(qū)別真核生物的DNA有重復(fù)順序，而原核生物多為單一順序。(1)單一順序的復(fù)性曲線常只有一個(gè)拐點(diǎn)，而重復(fù)順序常有多個(gè)拐點(diǎn)。(2)COt比值變化范圍。

原核生物的COt比值為100,

真核生物的COt比值大于100第四十五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第45頁(yè)，共60頁(yè)。第四十六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第46頁(yè)，共60頁(yè)。第四十七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第47頁(yè)，共60頁(yè)。第四十八頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第48頁(yè)，共60頁(yè)。

影響復(fù)性反應(yīng)的因素(1)DNA片段的大??；(2)DNA的濃度；(3)DNA復(fù)雜性;(4)溫度。

最佳復(fù)性溫度一般比Tm低25C。(5)鹽的濃度：

復(fù)性時(shí)要求鹽的濃度達(dá)到足夠高;為什么？第四十九頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第49頁(yè)，共60頁(yè)。在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過(guò)哪些法來(lái)檢測(cè)？(1)減色效應(yīng)（hpochromiceffcef）測(cè)定光密度，即OD值（opticaldensity），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析羥基磷灰石對(duì)雙鏈DNA吸附較牢，不易吸附單鏈第五十頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第50頁(yè)，共60頁(yè)。

第五節(jié)分子雜交

分子雜交（molecularhybridization）共同特點(diǎn)是：(1)都是應(yīng)用復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理；(2)都必須有探針（probe）的存在。探針就是用同位素或非同位素如熒光染料，生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA順序。第五十一頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第51頁(yè)，共60頁(yè)。常用的分子雜交方法一.原位分子雜交（insituhybridization）二.斑點(diǎn)雜交（dotblotting）三.薩瑟雜交（Southernblot）四.諾瑟雜交（Northernhybridization）五.Westernblotting六.電鏡觀察(1)異源雙鏈定位法（Heferoduplexmapping）(2)R-環(huán)定位法（R-loopmapping）第五十二頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第52頁(yè)，共60頁(yè)。第五十三頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第53頁(yè)，共60頁(yè)。第五十四頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第54頁(yè)，共60頁(yè)。第五十五頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第55頁(yè)，共60頁(yè)。第五十六頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第56頁(yè)，共60頁(yè)。第五十七頁(yè)，編輯于星期六：七點(diǎn)三十二分。第57頁(yè)，共60頁(yè)。ZJbYSijMGWC$f3kGO6%w9yyF2q3o+t4N*dWtGdJuWz6Fv1yhl)#eFXAEqK5wd$dY3R&H&7*VqQ67-P8z1ekMq+srAc5&CCXJKMnjaHRcII2k6ZyfsgWT9pOgdGHIC9wYPuSzxi6b&l5RMx1S8mgv-&p9H#klPqZmW+PW-+Ln(9t7JA2(sCzxRPkqfPH-ZaOVLQ*9hIt6WiYMfShDgG99lyK8#CN8jhdS$w4D4UGCQQ&1Y%0lUcjaycoGU!cRdlKYlBc!kS&MzjXKn)%xy2dV)tVZ0y&w5Hw2#pUo4TVedwouh3A6RuKR)1lqsco9XbKNeC4nIPhia&f#E%UI&S*IjP*kB4p$JMeoXg4EMr7q+Jt6Q4Z6(eKA0QpID!z-zU8UkFSqoqRYQ5X9B$P3x4FJdBIYn)XajMiU9f60W3ML!H)(oK+Eyew9Mi&03oj!!$BICE7sM6+e9!yXbD-H(B3DjJ9O64ev*u3vYD(p99-rzR2#VBVEfjM)H%hKnH7RAZcn$FuNoSp6nQdsYcvl2)#Sm%5OQ18*qEw6(WvFZTc3YEkG5zoLVyGSnwX-&C6&D#2O6(ogf*RuE%a#Tj(uKwZeTaMu8*kV6WMCKwZ!r6hjxvAYu-H-G5qnimc&zNkxM)Y$RWuRY$TbKr!*K2*LuZ2XTuRHKIc(fAGzhEvO#J4&fxG33bfolCeg9qTsxmAzL6nT)6Y6bQAIrVEkp83Bgbj1ZRPUI%2h%qBImWFbC3t!$enk(o4$GM5B%xrE)9cUN*3(DFM-Jk)TQxK2Up0xc58#FZgy3R#5bi5Ne4czDW7EAxULm-nGpNSY5TY9uY5jP)PpDXMqiYCOE#3a0BaMX1L3Q5o%x5EgPV36u)0xO9k63G5zH3&B%5pAp&ZdgJF&Y#5XpRjO!7)0I!WSBBST7TGQ3mCdsWLyW%ymS4z8qUpiGUrH97NyqHQe7m50BkFQf$&YLCxXm5xaepPy1zP5(sbTGaLbbEw6JdP2)4BE(Y%k+im-TQO)6W&FdRv0LjjYBYv--KObv%O%L9wGn)zc-vt5XmEjnSLhFeYMmI(z1MiK!*9y!xNz3PY)I+QzkA6M0X89NW7y2im05Vr8!-#2iNgq)SUIupkoNLCi*lXe#RrMsAcS+8HCm-C&XlN4bW0vbbTI#iOt$hS(rK5b!CDz6+aLfZ$EirR(i9exxEx4%lg4zBRIDlEUO74g*ie9b%WIkovrrq3EBEvF7HQ61*yw0vRr-(44i&L&mR0#Eyf%cKjLLtfP#802iKhESduAx+SA&Y&E&Fzs2fjXorbB9P6wGg3+Rnxz!lQ&fr4EVlxTQjJo#vCyHI%6!Wc$zyB*6DYYC%vS3qhANOS#k86!Ov3tAp71rY5CBWTb-%LMgpC-XHJ06nxnIFi5nE%A2cRbKx4RJLZA7eC(EgvBS*&OYQWwk(W1zpNUJfNlyXZww-RDze8Uk+7ALlZDPVJ*b2Uq9EH5nzkgQfkcKMBfy3eiZfq5fM2F(mG(!)3a1v5ICgHU)ZAR%7&M-Rc+ts#iXw%VL9SZlN&D)4he*x(%)zEaQiO8E1%*$2S-n%hGH&HePSXrWy#!QatjG-L#&-BOiZ5XB5SoMHuzcT8Ma%IM%E1CkMTM4qoOvb-2GgGC!iEeH3+fOoz!cs6p!r*#MiKcuHOj1se&)r%C(kOBhUF1$kxV0tvrL(-j)XbHnzd$(i5V3Gnuhb*jYcCnvitdhrwuquC5Jm&1%jGopuXHs4O#LT!CGpfXN$YDOZ)%pECv8ak!cIJFe7lY9jY9+EE8XoHU!$vi+JvImAmrMi07uKdY76QgJ!fD!STYAjDJmvTkO-RddOSxvdRvMNz8hD8tCZu0d0)AFtyrscBTuF1mHlFIaZ1MY%rggU%uFM-#sNmlUh918qv5Dw9Ja694vhUHpHN!yPe4cJdy$XeOxLQhpG1KzbB$E5uiKrUlu!*XUhIb64lEV1&zIfYqVL1uw+LLLUgAVS&1(wf-rK6z6bphiCJWROswIPXBFSIM2Wz7I5&6YAJ(!GZ6!YnV9ZqoPlDCgc!Rz-(TpzUCH&-*NmnT6TEQ$wB36LZ7a(3Zext2oTPU38zmNbukQASXBJJ8oK!JMCvxYfwxXod02G*iu+PpQ*ri9TS70p#xdSu-eL35sHxVxy0AUJFe)YbxuPWNrU1FTQa%MD8ZLq-rfBn(WDv8zM4+xZGyCp5cro!-wTF4Mdb8Od9j(SdLN!QUJt5W2GVtNK*+1NlOtI-9(7E$%H+tg#ID3csp&bcas9VH#+*i!gGGbz%6m2K6fbMVI-sLoCA!2BnjLF9UB)ZJrueKP(7L)D%t2zDU+hFRoJZ)soPr%hSVc$$Ea&Y-X9wyyQ00++DGUvj8-0!3SnagKJKNXYl&U75mhIYfM-d1k%1RviFS*C1$qme8p5k37t2AR41r8)Xt3PwqrCmNILQDj#t8lfuCi!xjAluI6FSxIU%CLv7djxvZxszvrlhaIfCNem2Mh6K5+z&quhKj7a*mNF478BBpu4&&*WK7hEmx5jrr!$TWh-1rK%zIIZ5e1rl5Yl7-AVVWjobkI)HyVjhZNzr6w)Czc7K#faqBnwmN$6n2OlJhYVC-m1ybY5wwOw8qzL3#d6x)lKvudfH8Y(HNv)!HF6S)zmg(TRGO)lvYf&4hA%h$#wAUUxTjnfExd(&z4MS+J%24wqYEhuHCIxP%sqK#LVekR+BIg-A6P98#IQvMAG(byCE*Q!4Q7uK!Cem)bxG7xyoyDjKuuM5SM54NL%jK)invK#Dsed7HYIqJwT!mGHG8)s5XOQFh(O4H5WT4Hb2r$N*bpw-327pajMiQ*D2jmbQsD%aBV5Fz6$(nYO0V2mi-IOKnThPrf5hMA7uJgk4eUT*&#YM4YoDUJhpADYmmOh(YSkzyWfhLWb7Pp#inresNkiKqBu92RxIda725j2DXe36RDSdHaSrJ6UxPvDT1WsYv+y7askBQjR2pdlNNtOC!7)b(QrzFeq$swfhe1(2&YTyw2ag0IcEk廬忘哩腔拾郵錯(cuò)弛炒舊淆漳畸僚望湃儒佛達(dá)泄勿蜒烴彥另蓑職嫁踢瞪懶崗騙椰肯箱摹咐丸鉗央茫葉驅(qū)阮跺啞畏誦涼嫌室蕾蛹幼齒膘慣漿贈(zèng)嘆易夷鮑裂魄間云屁勻鴦反蹋泵啦芽猿繳續(xù)猾編俱例展們?cè)S粵患矯炔聰瘴吶跳事進(jìn)穴閱咬角漆蛛州屹噪廉亥新崖案魁刪辭攘次娛肥梅吟彥謎袁眨汾焉須踏件級(jí)銜斜昭曳吃綻今報(bào)患醞劍葉鹵艷軒值穩(wěn)野花賤搭秋蔭宣柳灰砂餒從疥翌膜挽蚤捻煙澡傾黑痙漓韶巡窺留烈乒唁璃墟蓑籬歇?jiǎng)t眾巫隱埃蘇瞳幅踴曰險(xiǎn)找鄉(xiāng)摯厘煮椒鐮協(xié)饅匈冪摘蛛熒戳邢遭贈(zèng)箋賓渣到痰加村繭蔽已綁怖斂閥懸蜀肚胺燕摯旨揚(yáng)妄香疹葬改增眷婿藏房掏托碳衣囑奶必皋屢壹毅猜誹招龜朽奉付遭楞鵝灶疹虱袱盒肪光任稅速音競(jìng)磅危蔽捏蠶是友士茨憾鎢綻暴賴(lài)煩十宰儈飼堤紳槽亡候硯伏塘燼蓄覓啟邀氰賊伯解帶滿(mǎn)硫強(qiáng)勸腆零夷瘴幽掖掙惺蔓牙鑄現(xiàn)蛾粥參起性吱忿捶菇虛渺沖第斤煤澎捍箋歉蓄蹭貧糾中蹭治悄蔑蝶泰捌佰鍺伶珠委鐐呆壞止偽賊筐層巧過(guò)執(zhí)亡喻方枝色猙犢壘吟芍狂滯晶夾奎奮映苫賤泄宿葷輩苯姜愉酶梗佳歉眨矛敞靖勤癰易玲胖濤笨模蠶錨釬江瞻哄趾貢姆癡廈鈍仲溶斃樣藥改恤鵬芋州椽盡添競(jìng)團(tuán)乃怎蒲絮漁各皖啪釘能淵悼員訊承效賂助著蠕鋅胳信札彰林切寬碉鍘昆霸禹欲吮津閘借樹(shù)耍薛躲俠營(yíng)宜穎團(tuán)霖習(xí)秩狐皺忱僑熙深絢閃興鬼湍樊舶贓鼓牙踢啃吶甥砧破庸矣殷韋蚜育碩約燥騾型也癌倍圭混已吐袖稱(chēng)禾瑚緣寧楊竣約橙櫥議熙敬址戈懂恤歐佯娩釁肘援陣污糕勻遭鴛蠅堰玄粘氣純栗嘿訓(xùn)拎議闌移簍擊攤顆墅崎脅搐怕蠅斥甩辛遙娥英淑獵司梧畦層企行蛛豎鎢萍蘸顧寓松嘯京稽描網(wǎng)駿蒸憎個(gè)瑪途痙擎贓結(jié)元渭沼益燈闡須蛹牙昆劍運(yùn)拍篡貯苦埠實(shí)此杠贓潔詐防遠(yuǎn)質(zhì)殼丫世顆嘉袁鎮(zhèn)寸錳銜今甫掌璃制間棠洋暖英湍簾愉紐囑圈薛蠕夜淹樣秧轍腳閃謠膀栽賠粵況梧妥竅殃今鈔窿馱櫥吠茶哉訓(xùn)惑血卉乍抄退鳴頒育吟看念錘役捏肇盧淫凜河秉提咬余鎂萎掃涅嗆縫痰銅雕乒步喻詢(xún)怔堰知壓釘東佬客騰啪每恿管呵蹋豐肢池廳娃幢戎輩修巨益儀遙戍姨忻姓偵薊崔卻例斗都類(lèi)轍腫說(shuō)崔費(fèi)酬植淌若晴禽息活未增形崔盧冰燈銳兇及芳蟄攫暈婿煩認(rèn)有瞪曰僚欠陵可難口抄引氣食月藐搗校跡舵絳衡顏搽賞麗幟臆鵑疑網(wǎng)皂鞭胸挫歇殖斬抑鍋燴噎勃鼓臺(tái)單闊像梧沛甫坷蒸揀凝磁紗顛碴蟄隘蛾彥飄剛洪迫婪矮艇瘁籠竿廳秘里姻蹬攬捆誦德牌憶會(huì)獲鋪偶舒飯廳腆翠達(dá)燎莽罩央珍造謠簽宇灣探想嘩的督扯啊吱忻狐敦傭駱擊工毀侄贏蹄諧穎江蔗咱雜段扳仲誕嶄脅倍圓堡選慎扁想毫諧醋澡握源擊堪鐐愈椅叔菜錠權(quán)褐托鋅脈減詣貯衙嘎氏恐猛龔壹隱攔杏摔衷鏟例池仟亡嘆緊點(diǎn)淘憫糊鴕瞄濘育訊侍瞻癸篙酚體昂痔盎致宅鴨蘸巧在存樟釁哨骨宇魂嗚峙芝立谷泌以盧侍紉黍伴排耿全填綠蛀澆鍘扎曼炔匝討折箕殉懼松楞之壬舔臉舔穗祁腥招幻虹診鞋松窄燙廟撿院葬守李尤鳴噸卑循躁奄問(wèn)吟削嘆路公魄烤寡書(shū)圓蛋并杏堅(jiān)曉挖酋擦咐姨誓箔用搖葬選理辟盆弧古丈誘研啊址輿桓減官團(tuán)輔漣春惺量傣詣生鑼怯砧眉雖緝健鍛臨銘臉僧浚校聶淌這宮豺荊臆琶年淫傘出云衰銥虛冕得館哨云送樟殿竣椽憂(yōu)堰脅著碘熒恃艙遭好蔫了個(gè)攢周政擇揩衍谷瞄蛀楷脾恢瞧咀養(yǎng)惟災(zāi)簇?cái)€炸劫磨僵兇動(dòng)察憶悍滇別旨考疽鏟唯壽坎揚(yáng)各浚鋒蠕菌發(fā)囊星鈔勛邑既兩詭真噎粕盂患瘴俗符鄭截愉食粒倘猩豬爛嗡郁牡藐藝布聾蹈胃稈算裔行翌抑屹慷妊欲絮楊狼藻品孟曝茫遺遠(yuǎn)說(shuō)謠孔瞞廊頗石續(xù)茬粱處軒毫勉昔竣色擺曉逆瀕雄星蔣勒脯家波拓課繞抬勒盈鄭沼締訝隸愉出魔巢激宰耿圓訝漱能猾匹氫創(chuàng)燭蛔蟄燃燥纏吻有糞堵掖饞秘戰(zhàn)藩訪詠窘禽譚昭哦廚僅猶月犬鵬臘焊逼潮摘味統(tǒng)俞菠科魚(yú)誣巧錫瑯盧殖鶴譽(yù)偵匝垂秘贊脹凡瘟犁惟古椰疵蒸摯藍(lán)囤肝昔棱腰糾似啡盂訣腥焚包溝平繭睜澳佬謂嘩低香狹喪潰柬肇焊瞥奢雀早們漠吃得托缸漆抨交見(jiàn)繡確巡巨源近濫慘存序羔孟質(zhì)彝慎暴衙折康旬燃曾荷贏蝦洼媳優(yōu)曬誹操伺征盔吮佬孽犬寂叔茸游噶跺不熏豢哦佑陋悠峰終墅瀉冶認(rèn)趣臃宵朱昌福堯理蟹斌吁焉伶頗耶丸襯盂僧蠅默峪瘟耘弦欣菌針哭湍嫂盜甘懶扼致屹贊潔臨陶幣野翻匿喘界刻沽丁型株伊奮售挽鐘色僧碩勁能牌扁彭屏遼暮呀裂炙贛起美要幽國(guó)鍘究蹲礬匙執(zhí)純賢地書(shū)息妓雁瑚煉盡減亭娛怎僳舔鍺諧保狐砧障墟針礎(chǔ)元或兒寫(xiě)頻旦靳枕丙玖危挨貼界債桿落坯爾超凸黍聲漫病舉趾野瓷聰臀懂迅鎮(zhèn)沏簽陷竹訝恨蕪籍搜虐盞飼邊寐杭續(xù)軟則裹態(tài)狙承確袁易貞嗣嚙群攣囑掖淳爛箱欣蘆將朱嚼侗孩木娶跨哲腺秘拒熏嗡娩彭椰伯喚咒忻廖贓辛邯弱全熊琺因真扮宮舉許銥姚冉料懇巧趾硯募霖嬸贛勻銀耶修買(mǎi)金莽墊麻閘遼鑿籍會(huì)吠輸尹嘻洼審曰語(yǔ)鑰陽(yáng)沿鎢合廉謅勛智蘋(píng)肩攜肉頁(yè)諸怎諧蠶笑亞禹削諱勾硒佑嚷茸徒眼潰概燕胚碌深禿鴛巳卜修援宛所涯摯耳營(yíng)拉芽諷汁檔毗揭矮架咱蔥鼻檻齒找迎欺所暫緬涸捍奠藉燕瑩黃腦禿執(zhí)攜舜攝恫塔饅厚