男性不育的試驗室診斷及評價-南京醫(yī)科大學

男性不育的試驗室診斷及評價-南京醫(yī)科大學第一頁，共55頁。維持男性生育的基本條件：（1）睪丸內(nèi)產(chǎn)生足夠數(shù)量的精子。（2）精子在男性生殖管道內(nèi)獲得運動能力和受精能力，既精子的成熟。（3）輸精管道通暢。（4）具有正常的性功能。（5）附屬性腺功能正常。第二頁，共55頁。不育癥診斷的步驟：1.

病史采集:包括年齡、職業(yè)、生育史、疾病史、家族史等。2.

體格檢查：包括外生殖器和全身體檢。3.

實驗室診斷4.

特殊檢查第三頁，共55頁。一、精液常規(guī)分析┌精子（5%）精液組成┤┌精囊腺液（60%）－凝固因子、果糖└精漿（95%）├前列腺液（20%）－液化因子├尿道球腺液（3%）└睪丸液、附睪液——精子第四頁，共55頁。精液分段成分：

前段－睪丸液，附睪液（精子），尿道球腺液

中段－前列腺液

后段－精囊腺液第五頁，共55頁。精液變量的參考值：精液量：2～6ml顏色：灰白液化時間：<60分粘稠度：拉絲<2cmpH：7.2～8.0活率：>60%活力：A+B>50%或A>25%精子計數(shù)：>2000萬/ml畸形率：<30%膿細胞：<5個/HP（<1×106/ml)第六頁，共55頁。精子活力分級A級：快速前向運動B級：慢或呆滯的前向運動C級：非前向運動D級：不動第七頁，共55頁。影響精液常規(guī)數(shù)據(jù)準確性的因素：①

自身的波動性:要求首次檢查應(yīng)連續(xù)進行兩次,間隔時間7天—3周，兩次結(jié)果差異大時應(yīng)再檢一次。第八頁，共55頁。每周測定一次精子密度，連續(xù)120周，期間此人未服藥，也無發(fā)熱，結(jié)果顯示精子密度可有顯著性波動。第九頁，共55頁。②禁欲時間：要求2－７天③

采精方式：要求用手淫法或取精器取精。④

盛精容器：要求用對精子無毒性的玻璃或塑料容器。⑤

室溫：要求不低于20度⑥

觀察時間：要求精液液化后，取精后1小時內(nèi)檢測。⑦

檢測設(shè)備：冬天檢測應(yīng)注意保溫。第十頁，共55頁。精液常規(guī)異常的分析：1.

精液量異常1)

無精液癥：精液量<0.5ml或無病因：①性交不射精②逆行射精2)

少精液癥：精液量為0.5～2ml病因：①性交頻率過高②附屬性腺先天性發(fā)育不良③附屬性腺感染④雄激素水平下降⑤年齡因素3)

多精液癥：精液量>6ml病因：①附屬性腺感染②附屬性腺功能亢進第十一頁，共55頁。2.

精液液化及粘稠度異常①

精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流動性大。病因：精囊腺炎癥②

精液不液化或液化不全：液化時間>30分病因：前列腺功能障礙第十二頁，共55頁。3.

精液pH異常：測量方法：pH試紙(pH范圍6.1-10.0或6.4-8.0)①

pH過低：pH<7.2

原因：①輸精管和精囊腺的缺如②附睪病變②pH過高：原因：①精囊腺液分泌過多②前列腺液分泌過少第十三頁，共55頁。4.

精子記數(shù)異常：

正?！?0×106個/ml測定方法：①血球計數(shù)板②一次性精子計數(shù)板③Makler精子計數(shù)板④CASA儀1)

少精子癥：<20×106個/ml

嚴重少精子癥：<5×106個/ml2)

無精子癥：精液須經(jīng)離心，沉淀物中仍未見精子者，并須連續(xù)檢查三次尚可確診。3)

多精子癥：>250×106個/ml第十四頁，共55頁。第十五頁，共55頁。5.

精子畸形：觀察方法：①吉姆薩染色法或瑞士染色法②巴氏染色法③布賴恩－利什曼染色④肖爾染色法畸形分類：①頭部畸形：大頭，小頭，錐形頭，梨形頭，無定形頭，空泡樣頭，雙頭等。②頸和中段畸形：缺尾，彎曲尾，腫脹，過薄等。③尾部畸形：短尾，多尾，斷尾，卷尾，雙尾等④胞質(zhì)殘余體：常位于精子頸部第十六頁，共55頁。第十七頁，共55頁。第十八頁，共55頁。第十九頁，共55頁。第二十頁，共55頁。第二十一頁，共55頁。第二十二頁，共55頁。第二十三頁，共55頁。６．白細胞檢查：①

正甲苯胺藍過氧化酶染色法：結(jié)果：白細胞染成棕紅色②

聯(lián)苯胺法：染料：聯(lián)苯胺＋玫瑰紅結(jié)果：白細胞－褐色；其它細胞－品紅色。

第二十四頁，共55頁。二．精子運動特性的檢測和分析1.

顯微鏡觀察：注意事項：(1)取精液10ul，滴于玻片，蓋上22×22蓋玻片，靜置1分鐘后觀察。(2)控制溫度，最好在37℃進行(3)每次觀察4～6個視野，計算100個細胞，計算A級、B級、C級和D級精子的百分比，連續(xù)觀察兩張滴片，誤差不得>10%。第二十五頁，共55頁。2.

多點曝光技術(shù)：在1秒鐘內(nèi)對精子連續(xù)曝光6次，可判斷精子的運動速度及運動軌跡。

精子運動速度分布：快速：≥25微米/秒中速：10—25微米/秒慢速：<10微米/秒第二十六頁，共55頁。第二十七頁，共55頁。3.

計算機輔助的精子分析系統(tǒng)（CASA）原理：用高分辨率攝像機實時記錄精子及精子運動圖象，用分析軟件對圖象進行處理和分析，并得出結(jié)果。硬件：顯微鏡，攝像機，微機軟件：圖象分析系統(tǒng)第二十八頁，共55頁。參數(shù)及意義：1)

運動精子密度：①活動率②前向運動率2)

活力參數(shù)：①平均路徑速度②曲線速度③直線速度第二十九頁，共55頁。第三十頁，共55頁。不足之處：①

價格高②

誤判多：特別是脫落細胞多時③

不能識別畸形精子、膿細胞④對待檢標本的精子密度有一定要求：精子數(shù)量少時，計數(shù)偏高，精子數(shù)量高時，活率偏高。

第三十一頁，共55頁。４．宮頸粘液穿透試驗：1)

體內(nèi)試驗：性交后試驗（PCT）注意事項：①排卵期進行②禁欲至少2天③最好在性交后9～24小時進行觀察。診斷標準：正常為宮頸粘液中的活動精子數(shù)>50個/HP或A級精子>20個／HP第三十二頁，共55頁。影響因素：①女方的內(nèi)分泌狀況。②宮頸粘液中的白細胞。③陰道pH，<7或>8.5可導致PCT異常。④宮頸結(jié)構(gòu)異常。⑤抗精子抗體影響。⑥性功能異常,如陰道痙攣。⑦精子質(zhì)量差。第三十三頁，共55頁。2)

體外試驗：①

玻片試驗②

精子－宮頸粘液接觸試驗③

毛細管試驗:穿透介質(zhì):人宮頸粘液;宮頸粘液代用品:牛宮頸粘液;含人血清精子營養(yǎng)液;含牛血清白蛋白精子營養(yǎng)液;鮮雞蛋清;第三十四頁，共55頁。５．精子頂體酶測定（明膠膜法）：1)

制備5%明膠溶液，吸取100ul均勻涂于載玻片上，自然干燥，4℃濕盒備用，使用前用甲醛－酒精固定液固定60分鐘。2)

精子處理：取液化精液，用PBS稀釋至2～4×106個/ml。3)

涂片：取1滴精液涂于明膠膜上，37℃濕盒2小時。4)

觀察：于相差顯微鏡下計數(shù)有反應(yīng)精子的百分率及精子的平均反應(yīng)直徑。5)

正常值：平均反應(yīng)率≥65%，平均反應(yīng)直徑≥25μm。第三十五頁，共55頁。第三十六頁，共55頁。第三十七頁，共55頁。第三十八頁，共55頁。6．去透明帶倉鼠卵穿透試驗1)

精子準備：①

精液充分液化②

調(diào)整精子濃度至10×106個/ml③

精子獲能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空氣中，37℃孵育18～24小時，調(diào)整精子濃度至4×106/ml。第三十九頁，共55頁。2)

卵細胞準備：①

取動情第一天倉鼠，腹腔內(nèi)注射PMSG30～40U，48～72小時后再次注射HCG30～40U，18小時后輸卵管內(nèi)取卵。②

1%透明質(zhì)酸去除卵丘細胞，0.1%胰蛋白酶去除透明帶。3)

體外受精：將0.1ml精液加至液體石蠟下，再加入20～30個倉鼠卵，培養(yǎng)3小時。4)

結(jié)果觀察：

相差鏡下見卵丘細胞內(nèi)膨大的精子頭為受精卵，計算受精率，正常為≥10%。第四十頁，共55頁。第四十一頁，共55頁。三．精液生化指標檢測1.

酸性磷酸酶測定（ACP）原理：P－硝基酚磷酸二鈉ACP→P－硝基酚測定產(chǎn)生的P－硝基酚含量，推測ACP的活性正常值：≥200U／一次射精意義：反映前列腺功能第四十二頁，共55頁。2.

果糖測定：間苯二酚法原理：果糖＋間苯二酚加熱→紅色化合物測定化合物含量正常值：0.87～3.95g/L意義：反映精囊腺功能與精子供能有關(guān)3.

α－糖苷酶測定原理：麥芽糖α－糖苷酶→葡萄糖測定葡萄糖含量正常值：35.1～87.7U/ml意義：反映附睪功能第四十三頁，共55頁。四．抗精子抗體測定1.

常用方法：1)

凝集試驗：原理：大分子或多價抗體如IgM或分泌型IgA可以在精子間形成交鏈，產(chǎn)生精子凝集，觀察。①

試管－玻片凝集試驗（FramRlin-Dukes）：將待檢樣本與液化的精液混合后，于３７℃孵育１小時，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)３條以上精子頭－頭、尾－尾或頭－尾連接即為凝集，觀察１０個視野，５個以上出現(xiàn)凝集即為陽性。②

圓盤凝集試驗（Friberg）③

凝膠凝集試驗（Kibrick）缺點：假陽性高第四十四頁，共55頁。2)

精子制動試驗（Isojima）：原理：在補體參與下，精子表面的抗精子抗體可抑制精子的運動能力。缺點：敏感性差，IgA的作用常測不出，吸附于精子頭部的AsAb作用也常常測不出。第四十五頁，共55頁。3)

直接免疫熒光試驗：原理：用熒光素標記抗人免疫球蛋白抗體與精子混合后，如精子表面有抗體，則標記的二抗吸附于精子表面，出現(xiàn)熒光。優(yōu)缺點：方法敏感，假陰性少，且可確定吸附部位，但假陽性多。4)

免疫珠試驗：原理：將聚丙烯珠與兔抗人免疫球蛋白相連，如精子表面有抗精子抗體，則免疫珠與精子表面吸附，光鏡下即可觀察到，計數(shù)吸附在免疫珠上的活動精子數(shù)，計算百分比，且可確定吸附部位。優(yōu)缺點：結(jié)果可靠，且可進行抗體分類和定位，但價格較貴。第四十六頁，共55頁。5）混合抗球蛋白抗體試驗（MAR試驗）：原理：將精液與包被了IgG或IgA的乳膠顆?；蚣t細胞混合，在加入二抗，顆粒與活動精子間形成混合凝集預(yù)示精子表面存在IgG或IgA.第四十七頁，共55頁。6)

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：原理：將精子抗原吸附于酶標板上，加入待檢樣本，如有AsAb則吸附于精子抗原上，加入酶標二抗，與AsAb結(jié)合，最后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。優(yōu)缺點：可大規(guī)模使用，但有假陽性和假陰性，必須設(shè)定陽、陰性對照。第四十八頁，共55頁。五．激素測定六．遺傳檢測（一）染色體檢查１．染色體的非整倍體１）性染色體的非整倍體精子發(fā)生需要性染色體的平衡，即一個X和一個Y，X或Y的數(shù)目異常均可導致精子發(fā)生異常。第四十九頁，共55頁。(1)47,XXY男性（Klinefelter’ssyndrome），發(fā)生率1：500，睪丸發(fā)育不良，精子發(fā)生障礙；46,XY/47,XXY亦經(jīng)常發(fā)生，伴有無精子或少精子。(2)48,XXXY，49,XXXXY表型為女性，陰莖發(fā)育不良，隱睪。(3)46,XX男性：由于Y染色體的短臂（Yp11）異位到X染色體的短臂上（Xp22）。內(nèi)生殖器表現(xiàn)型取決于Yp11的斷裂部位，Yp11遠端（SRY附近）的斷裂常導致隱睪、小陰莖、尿道下裂。(4)45,X男性，較少見，為Y長臂缺失，短臂異位至常染色體上（13,15,22常見）。(5)47,XYY發(fā)生率1：750，活檢顯示曲精小管受損，生精阻滯于精母細胞階段，有時有精子生成。少數(shù)人能生育，但胚胎易死亡，或后代有異常染色體，45－75%精母細胞帶有二個Y。(6)Y－A平衡異位：Y長臂遠端的異染區(qū)（Yq12）轉(zhuǎn)移至端著絲粒常染色體的長臂上，Y長臂斷裂在Yq11上，斷裂部位對精子發(fā)生的影響較大，距Yq11較近時，精子發(fā)生基因受損，致精子發(fā)生障礙。斷裂距Yq11較遠時，精子發(fā)生可正常并能生育，但帶有Y－A異位的很易再斷裂而引起不育，或?qū)愇粋鹘o子代，使子代發(fā)生斷裂而導致精子生成障礙。第五十頁，共55頁。2)常染色體的非整倍體

在不育男子中，常染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生率是有生育能力男子的10倍。(1)男性Turner氏綜合征（Noonan綜合癥）：為常染色體顯性或隱性遺傳病，染色體核型常為46,XY，或XO/XY嵌合體。臨床表現(xiàn)：身體矮小，頸蹼，典型的臉部特征，心臟缺陷，隱睪，無精子或少精子癥，血睪酮下降，F(xiàn)SH和LH升高。21三體（Down綜合