8.細菌與病毒的微生物學檢查法

2021/10/101

第七章細菌與病毒的微生物學檢查法微生物學教研室Jiz-Zhaoj12zhao@2021/10/102教學大綱掌握內容標本的采集和送檢原則病原菌的檢驗程序細菌感染的血清學診斷及常用方法了解內容病原體的抗原成分、核酸及其他成分的檢測方法2021/10/103病原學檢查的目的進行病因學診斷指導合理用藥觀察治療進行傳染病的流行病學調查2021/10/104標本的采集和送檢六原則※無菌操作：避免雜菌污染不同期不同標本用抗生素以前采集病變明顯部位運送注意保存采集雙份血清2021/10/105第一節(jié)細菌感染的微生物學檢查法2021/10/106可疑細菌感染采集標本血清學實驗雙份血清直接形態(tài)學檢查細菌成分檢測特異性抗體檢測細菌分離培養(yǎng)鑒定形態(tài)學檢查生化學檢查血清學鑒定藥物敏感實驗動物（毒力）實驗抗原檢測核酸檢測直接凝集實驗協(xié)同凝集實驗乳膠凝集實驗免疫熒光檢測ELISA等核酸雜交聚合酶鏈反應（PCR）DNA芯片凝集反應沉淀反應補體結合試驗中和試驗ELISA等2021/10/107細菌學診斷

檢測病原菌成分檢測患者血清中特異性抗體細菌病原學檢查法形態(tài)學檢查分離培養(yǎng),純培養(yǎng)生化試驗血清學鑒定藥物敏感試驗毒力實驗動物實驗抗原核酸2021/10/108一、細菌學診斷2021/10/109（一）形態(tài)學檢查光學顯微鏡檢查法：細菌染色檢查法革蘭染色法抗酸染色法負染法暗視野檢查：用于檢查活菌、螺旋體及其動力熒光顯微鏡2021/10/1010腦脊液的直接涂片染色-肺炎鏈球菌2021/10/1011鏈球菌2021/10/1012淋病奈瑟球菌-膿液直接涂片2021/10/1013結核分枝桿菌2021/10/1014霍亂弧菌2021/10/1015暗視野顯微鏡鉤端螺旋體2021/10/1016肺炎雙球菌2021/10/1017病原菌的分離培養(yǎng)/直接涂片大小形態(tài)顏色表面性狀透明度溶血性Flamesterilizewireloop,metalforceps,etcbeforeandafteruseinahoodedBunsenburner2021/10/1018細菌動力的檢測2021/10/1019化膿性球菌葡萄球菌鏈球菌2021/10/1020腸道桿菌大腸埃希菌沙門氏菌志賀菌細菌形態(tài)無特異性可采用生化學檢查法-鑒別細菌的重要方法2021/10/1021（二）生化試驗

糖發(fā)酵試驗H2S試驗枸櫞鹽利用試驗2021/10/1022鑒定中最重要的生化反應※乳糖發(fā)酵試驗腸道非致病菌（埃希菌屬）發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣＋腸道致病菌（志賀菌屬、沙門菌屬等）不發(fā)酵乳糖—2021/10/1023（三）血清學鑒定利用含已知的特異性抗體的免疫血清，檢測未知的細菌抗原，對細菌進行種的鑒定志賀菌屬、沙門菌屬常用方法是玻片凝集試驗2021/10/1024測定抗生素或其他抗微生物制劑在體外抑制細菌生長的能力方法：擴散法、稀釋法（四）藥物敏感試驗2021/10/1025MIC&MBC最低抑菌濃度，MIC最低殺菌濃度，MBC2021/10/1026全自動分析儀全自動細菌鑒定儀全自動生化分析儀2021/10/1027（五）檢測毒力-動物實驗1.常用動物

Mouse

GuineaPig

RabbitDogMonkey2021/10/1028接種途徑皮內皮下腹膜內靜脈顱內椎管內鼻內灌胃2021/10/1029毒力檢測半數(shù)致死量

LD50半數(shù)感染量

ID502021/10/1030二、檢測病原菌成分抗原的檢測核酸的檢測2021/10/1031（一）抗原的檢測利用已知的特異性Ab檢測Ag的方法常用的方法有玻片凝集協(xié)同凝集試驗ELISA免疫熒光法2021/10/1032ELISA2021/10/1033（二）核酸檢測方法聚合酶鏈反應（PCR）核酸雜交技術SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization基因芯片(Genechip)16SrRNA2021/10/103416sRNA基因序列分析只存在于原核細胞型微生物的染色體基因中16sRNA，23sRNA,5sRNA可變區(qū)和保守區(qū)保守區(qū)：所有的細菌所共有可變區(qū)：屬和種的特異性2021/10/1035PCRGeneChip2021/10/10362021/10/1037三、抗體的檢測用已知細菌或其Ag檢測相應的特異性Ab及其量的多少，作為某些病原菌感染的輔助診斷急性期和恢復期雙份血清，恢復期效價升高≥4倍有診斷價值方法玻片或試管凝集試驗、沉淀試驗、補體結合試驗、冷凝集試驗、ELISA局限難以早期診斷2021/10/1038第二節(jié)病毒感染的微生物學檢查法形態(tài)學病毒的分離鑒定在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標病毒成分的檢測病毒抗體的檢測2021/10/10392021/10/1040（一）病毒的形態(tài)學檢查

電子顯微鏡（EM）

免疫電鏡,IEM光學顯微鏡（CM）包涵體內基小體（Negribody）HAVNegribody2021/10/1041動物接種：動物模型雞胚接種：9～14d組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)二倍體細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法（二）病毒的分離培養(yǎng)的方法2021/10/1042血凝抑制實驗中和實驗PCR檢測病毒分離培養(yǎng)及鑒2021/10/1043細胞病變（cytopathy)

※紅細胞吸附(hemadsorption)病毒干擾作用(viralinterference)中和試驗(neutralizationtest,NT)空斑形成試驗(plaqueformation)病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標※2021/10/1044細胞病變—細胞病變效應※

（CPE）

細胞病變效應（CPE）A：未感染病毒的HeLa細胞；B：被柯薩奇病毒B3感染后，細胞變圓、皺縮，細胞折光性減弱；C：被腺病毒感染后，細胞腫脹，折光性增強，呈葡萄狀排列。200

50%組織細胞感染量TCID50:根據(jù)有無細胞病變來判斷病毒感染性和毒力的指標2021/10/1045細胞病變紅細胞吸附：血凝素（HA）病毒干擾作用中和試驗病毒數(shù)量及感染性的檢測空斑形成試驗紅細胞凝集紅細胞吸附病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標plaque2021/10/1046空斑形成試驗用于病毒濃度的精確定量和測定抗病毒藥物的作用一個空斑是由一個病毒大量復制而成，稱為空斑形成單位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示2021/10/1047（三）病毒成分的檢測病毒抗原的檢測:ELISA病毒核酸的檢測核酸雜交、PCR、基因芯片2021/10/1048病毒成分的檢測2021/10/1049（四）病毒抗體的檢測中和試驗（NT）血凝抑制試驗（HT）補體結合試驗（CF）ELISA法蛋白印跡技術2021/10/1050小結細菌感染的微生物學檢查法病原體檢查核酸的檢測抗原、抗體的檢測病毒感染的微生物學檢查法電鏡及免疫電鏡病毒的分離培養(yǎng)和鑒定核酸的檢測抗原、抗體的檢測2021/10/1051小結抗細菌免疫固有免疫※獲得性免疫抗病毒免疫固有免疫干擾素※獲得性免疫2021/10/1052問題采集標本的原則？病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標？干擾素的概念及其抗病毒機制2021/10/1053自檢內容1.機體抗結核分枝桿菌的感染免疫主要依賴A.屏障結構B.細胞免疫C.抗體的中和作用D.非特異性免疫分子E.吞噬細胞的吞噬作用2.滅活和清除游離病毒主要依靠A.干擾素B.抗體C.細胞因子