動物細胞培養(yǎng)技術(shù)

關(guān)于動物細胞培養(yǎng)技術(shù)第1頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1.動物細胞的生長與培養(yǎng)動物細胞的特點進化程度高結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜細胞間連接形式多樣生長相對緩慢功能全面第2頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征Hepatocytes第3頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月體外培養(yǎng)細胞的分型

（一）貼附型

成纖維細胞型上皮型細胞游走細胞型多形型細胞（二）懸浮型（三）半貼壁型第4頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞貼附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結(jié)果:

基于貼附特性，使細胞與細胞之間相互結(jié)合形成組織，有機體的絕大多數(shù)細胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細胞第5頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征體外：多數(shù)情況，細胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型

第6頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1、成纖維細胞型：第7頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞：心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起第8頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月2、上皮型細胞：第9頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動第10頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。4、多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

第11頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：自血，脾或骨髓，血中白細胞癌腫細胞特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：純化不方便，不能通過離心將死、活細胞分離第12頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌無毒害的環(huán)境1支持生長增殖的營養(yǎng)2其它類似體內(nèi)的環(huán)境3維持細胞性狀41.2細胞培養(yǎng)總原則第14頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)細胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境實驗室設(shè)計合理常用設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿：透明度好、無毒、利于細胞貼附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。第15頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù)工作環(huán)境及表面的處理細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細胞的處理第17頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。其它成分（條件培養(yǎng)基）第18頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月合成培養(yǎng)基的主要成分氨基酸碳水化合物無機鹽維生素其它輔助物質(zhì)培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）McCoys5AM199F12第19頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月血清牛血清、馬血清、人血清（1）儲存于-20℃—-70℃低溫冰箱中（2）一般廠商提供的血清為無菌（3）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補體成分（complement）滅活（4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理。第20頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月其它常用液體試劑Hank’sD-Hank’sPBSNaHCO3（7.5%

）胰酶溶液（0.25%）第21頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)其它類似體內(nèi)的環(huán)境溫度氣體滲透壓氫離子濃度(PH)其他第22頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)合理的計劃，維持細胞性狀

盡早凍存原代細胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細胞需要做實驗的細胞要選對數(shù)生長期防止細胞污染，如遇污染，及時處理第23頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月一、細菌污染細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。第24頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月二、真菌污染

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。第25頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月三、支原體污染

支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。

培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。第26頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月四、病毒污染采用組織細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細胞系。第27頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月五、非同種細胞污染

由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認為是HeLa細胞。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。第28頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的排除微生物污染的方法

抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)物，有時可能奏效。加溫除菌：根據(jù)支原體不耐熱的特點，可將受支原體污染的細胞至于41攝氏度作用5～10h（最長可達18h），以殺滅支原體。動物體內(nèi)接種：受污染的腫瘤細胞可接種在同種動物皮下或腹腔內(nèi)，利用動物的免疫功能消滅污染的微生物，而腫瘤細胞卻能在動物體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時間后從體內(nèi)取出腫瘤細胞進行培養(yǎng)與巨噬細胞共培養(yǎng)：巨噬細胞在體外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用這一特點，可將少量的污染細胞與足夠量的巨噬細胞共培養(yǎng)，從而消除污染。第29頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)單個細胞第30頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞懸液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變第31頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。有關(guān)概念第32頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞的原代培養(yǎng)

將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

第33頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月組織塊直接培養(yǎng)法（機械法）1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1-2mm），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中4、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面5、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)

第34頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月胰酶消化法1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細胞。6、靜置，使未分散的組織塊下沉。7、吸取上層細胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個培養(yǎng)皿中，補加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。第35頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）培養(yǎng)細胞生命期在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。

第36頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點：1一4周、細胞呈活躍的移動、可見細胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上與體內(nèi)原組織相似性、多呈二倍體核型細胞群是異質(zhì)的，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。第37頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月2．傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。第38頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月3．衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點，由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性。第39頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。第40頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期

所謂細胞“一代”一詞，系指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：?潛伏期指數(shù)生長期停滯期第41頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1．潛伏期：第42頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月過程:游離:懸浮,胞質(zhì)回縮,全部細胞變?yōu)閳A球形吸附:貼附底物,一般24小時內(nèi)貼壁潛伏期:可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相第43頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月

影響因素：

潛伏期的長短與：細胞種類接種的細胞密度培養(yǎng)條件第44頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1.細胞類型傳代培養(yǎng)的細胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短。傳代培養(yǎng)期的細胞6-24h;原代24-96h或更長單個細胞快,細胞大團慢,組織塊慢連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細胞(6-24h)比有限細胞系與正常二倍體細胞的短來源：胚胎組織:短,2天可見細胞生長，成體:長

第45頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月2.細胞密度

密度越大、數(shù)量越多，細胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長3.培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液、pH底物、污染,有毒

第46頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月2．指數(shù)增生期：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細胞分裂指數(shù)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。第47頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月特點：

是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細胞群體均一是理想的實驗用細胞接觸抑制密度抑制第48頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月3．停滯期：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡第49頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月特點

(1)細胞數(shù)量：

細胞達飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。

(2)細胞活動小(3)生長組分下降

(4)及時傳代：細胞已中毒，即使傳代，也會影響下一代細胞的功能狀況第50頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月潛伏期指數(shù)生長期停滯期第51頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞計數(shù)及活力測定培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)，結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。第52頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞計數(shù)原理第53頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞計數(shù)操作步驟

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

第54頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月請計算一下~~~~~~~~~~~~細胞毒實驗需要效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為20：1且靶細胞需要1x104/TEST?，F(xiàn)有效應(yīng)細胞10ml，取100ul效應(yīng)細胞加入900ulPBS中，混勻后記數(shù)，細胞濃度為2x104/ml。靶細胞也有10ml，經(jīng)記數(shù)，細胞濃度為1x105/ml。效應(yīng)細胞共有多少？靶細胞共有多少？以現(xiàn)有的細胞做實驗，能做幾個TEST？第55頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞活力測定步驟

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。第56頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月哺乳動物細胞冷凍保存主要目的：（1）保存種子細胞，以便隨時取用。（2）降低人力和物力（3）減少細胞被微生物污染的危險性。（4）避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變（5）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變第57頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凍保存要點（1）冷凍過程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1到-3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中長期保存（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。（3）細胞濃度控制在：1×106－1×107/ml。（4）使用高濃度血清（30%）（5）使用合適的細胞冷凍保護劑（DMSO、甘油）細胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護劑（5-10%，培養(yǎng)基（60%），血清（30%）。第58頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞凍存實用程序收集細胞凍存液重懸分裝入凍存管106-107/mL4℃40min-20℃30-60min-30℃30min-80℃過夜液氮罐保存并記錄第59頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凍保存細胞的解凍與復(fù)蘇（1）快速解凍（2）解凍操作過程動作要輕特別注意：解凍時務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染第60頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月解凍冷凍保存細胞的離心方法:從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。將1－2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻。用80g離心2－3分鐘（800-1000rpm5min），棄上清液。用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞。接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度不低于3×105/ml。24-48h后換液。第61頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4體外培養(yǎng)細胞的種類

細胞系細胞株二倍體細胞遺傳缺陷細胞腫瘤細胞第62頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）細胞系

初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系。第63頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）細胞株

從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株第64頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）二倍體細胞

細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75％或80％以上）的細胞群，稱二倍體細胞。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種。第65頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）遺傳缺陷細胞

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。

第66頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）腫瘤細胞系或株

這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。

第67頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞系或細胞株的命名

HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。第68頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞系或株的鑒定、管理和使用

ATCC入庫細胞要求檢測項目如下：

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量第69頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無

無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種檢測：檢測同工酶，以證明細胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測

免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測

細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名第70頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第71頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第72頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第73頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第74頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞凋亡細胞凋亡:是能量依賴的細胞內(nèi)死亡程序活化而致的細胞自殺，由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程。細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）:指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。第75頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞凋亡與壞死的區(qū)別——————————————————壞死凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性,非遺傳性生理性或病理性，特異性遺傳性2.誘導(dǎo)因素強烈刺激（極端環(huán)境），隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白合成，主動過程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形態(tài)變化細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、胞膜及細胞器相對完整細胞腫脹細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片段化（180-200bp），

DNA片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控?zé)o有第76頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第77頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月常用細胞凋亡檢測方法細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）線粒體膜勢能的檢測DNA片斷化檢測TUNEL法Caspase-3活性的檢測

凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析第78頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測第79頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中.Annexin-V是一種分子量為35～36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來第80頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium第81頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。

第83頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300kbp長的DNA大片段，或180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。第84頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月TUNEL法細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3‘-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

第85頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月第86頁，課件共100頁，創(chuàng)作于2023年2月2.干細