第四章抗體制藥1

本章目的要求1、掌握單克隆抗體的概念。2、理解制備單克隆抗體的一般流程。3、理解基因工程抗體的制備。4、理解噬菌體抗體庫的基本方法、技術(shù)特點(diǎn)及基因工程抗體的表達(dá)。5、掌握抗體診斷試劑的分類。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)學(xué)習(xí)內(nèi)容（一）1、抗體制藥概述2、單克隆抗體制備的基本過程。3、基因工程抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)第一節(jié)概述?1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。?1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。?70年代中期，日本利根川進(jìn)證實(shí)了Ig的基因結(jié)構(gòu)，獲得1987年的theNobelprize?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體？是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。抗體的產(chǎn)生？機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)多克隆抗體polyclonalantibody指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。實(shí)際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，副作用：超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點(diǎn)：特異性差。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)單克隆抗體

monoclonalantibody，McAb1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)第二節(jié)McAb及制備一、McAb1、McAb定義

是由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞及其后代所產(chǎn)生的針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的高度特異性和專一性的抗體。2、McAb怎樣產(chǎn)生？

是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)二、McAb的制備1、抗原與動(dòng)物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)免疫方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)可溶性抗原按每只小鼠10～100

μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，刺激B細(xì)胞分裂?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點(diǎn)：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)體外免疫法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO237C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)2、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的方法脾細(xì)胞（1×108）骨髓瘤細(xì)胞（2～3×107）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。P25抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對(duì)分子質(zhì)量4000為佳。相對(duì)分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)，長(zhǎng)期穩(wěn)定。細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細(xì)胞如何去除脾-瘤以外的融和細(xì)胞？選擇性培養(yǎng)－脾-瘤培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻斷DNA合成。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)3、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測(cè)方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)4、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定

雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標(biāo)，了解分泌抗體的能力。

單抗進(jìn)行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA鑒定。親和力、特異性、純度、分子量測(cè)定。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定—染色體分析正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為62~68，NS-1為54~64，大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點(diǎn)。雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)的抗體；反之，則反?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)5、

McAb的大量制備體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲的5～20mg/ml抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)6、McAb的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：（1）澄清和沉淀處理：1000g離心5min，去除沉淀物（紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質(zhì)）——20000g高速離心30min,去除殘留的小顆粒物質(zhì)——用0.2μm微孔濾膜過濾，去除細(xì)菌、支原體——飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)（2）分離A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200作為分離介質(zhì)，可收集到3個(gè)峰，最高峰為IgM，另外兩個(gè)峰為IgG。抗體回收率達(dá)50~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達(dá)95%以上。B、陰粒子交換層析：用于IgG類的分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低粒子強(qiáng)度下洗脫下來，其純度很高。IgG2b和IgG3在低粒子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加粒子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量，但其純度相對(duì)較低。

C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適用于IgG類。IgG類與蛋白A的結(jié)合與pH有密切的關(guān)系。鼠源性單抗在pH8.0時(shí)，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫下IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度和很高，但也有極微量的雜蛋白?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長(zhǎng)漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)

Bcell只產(chǎn)生一種抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)

●

一個(gè)B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對(duì)付某一抗原決定基●若有許多抗原決定基，則需許多株B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開Turn20抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞（Subcloning）

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)第三節(jié)基因工程抗體

GeneticEngineeringAntibodyMcAb具有高度特異性、均一性、又有來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，促進(jìn)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等眾多學(xué)科的發(fā)展。存在的缺陷，McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)有排斥反應(yīng)；完整抗體分子的相對(duì)分子量過大，難以穿透腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。降低McAb的免疫原性；降低McAb的相對(duì)分子量?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)對(duì)鼠源性的McAb進(jìn)行基因加工和改造目的：降低免疫源性；降低相對(duì)分子量方式：一、人-鼠嵌合抗體二、改形抗體三、Fab與Fv抗體四、scFv五、單域抗體和分子識(shí)別單位抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)一、人-鼠嵌合抗體ChimericAntibodies人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會(huì)帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)二、改形抗體ReshapingAb（CDR移植抗體）CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡(jiǎn)單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對(duì)影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)最小識(shí)別單位單域抗體FabFvScFvFab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別單位等都是小分子抗體小分子抗體抗體制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)三、Fabfragmentofantigenbinding重鏈VH加CH1和完整的輕鏈組成,大小為完整分子的1/3把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性?？贵w制藥BiotechnologicalPharmaceutics目前四十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十一點(diǎn)四、Fv及ScFvFv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在V