義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座

食品微生物檢驗(yàn)

規(guī)范操作基礎(chǔ)培訓(xùn)

5制片、染色及顯微觀察

福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品所微生物試驗(yàn)室

.05

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第1頁主要內(nèi)容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養(yǎng)基制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6試驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第2頁5.1顯微操作顯微鏡是微生物檢驗(yàn)中最慣用精密光學(xué)儀器。顯微鏡種類很多，在試驗(yàn)室中慣用有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗(yàn)中最慣用是普通光學(xué)顯微鏡。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第3頁義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第4頁顯微鏡使用方法

用光學(xué)顯微鏡觀察微生物形態(tài)時(shí)，普通遵照先低倍鏡觀察，后高倍鏡觀察，再油鏡觀察。

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第5頁低倍鏡操作方法1.兩眼從側(cè)面注視低倍物鏡對準(zhǔn)通光孔，使用粗調(diào)焦螺旋將鏡筒自上而下調(diào)整，防止物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當(dāng)物鏡鏡頭與載物臺(tái)玻片相距2～3mm時(shí)停頓；2.左眼注視（注意右眼應(yīng)該同時(shí)睜著），并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒漸漸上升，直到看清物象為止；3.再用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清楚。

注意：粗調(diào)調(diào)焦螺旋只用于上調(diào)載物臺(tái)，如觀察顯微鏡時(shí)，用粗調(diào)整器調(diào)整，有壓碎載玻片、損壞物鏡危險(xiǎn)。所以，用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)整視野使其更清楚義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第6頁高倍鏡操作方法1.將低倍鏡觀察到目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將低倍鏡鏡頭轉(zhuǎn)換成高倍鏡鏡頭。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，所以普通選取較大光圈并使用反光鏡凹面；3.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清楚。觀看物體數(shù)目變少，不過體積變大。

注意：高倍鏡觀察時(shí)，光線需增強(qiáng)。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第7頁油鏡操作方法1.將高倍鏡觀察到目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油；3.將油鏡鏡頭移動(dòng)至視野，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴(kuò)大為止）；4.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清楚。

注意：油鏡操作需要較強(qiáng)關(guān)線，故需將光線調(diào)至最強(qiáng)。

用10倍和/或40倍物鏡為隨即高倍油鏡（90倍或100倍）選擇適當(dāng)視野（油鏡鏡筒上通?？逃蠬.I.OIL或OEL等標(biāo)志）義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第8頁油鏡用后處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留油跡；第三遍：再用潔凈擦鏡紙擦去殘留二甲苯。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第9頁普通顯微鏡保養(yǎng)

(1)觀察完后，移去觀察載玻片標(biāo)本。(2)用過油鏡，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最終再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡位置。(4)將鏡身下降到最低位置，調(diào)整好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器位置，罩上防塵套。鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛擦鏡紙，物鏡清洗，可選取不一樣溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全是二甲苯。

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第10頁§5.2制片和染色

染色原理

因?yàn)槲⑸锛?xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明，與周圍背景沒有顯著反差,必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后菌體與背景形成顯著色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其它化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。細(xì)菌帶負(fù)電荷多，輕易與帶正電荷堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色較多。微生物中細(xì)菌、致病菌是很小生物體，必須經(jīng)過染色方法，在顯微鏡下才能看得清楚，而且還能夠經(jīng)過染色方法判別革蘭氏染色特征，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第11頁細(xì)菌形態(tài)桿菌螺形菌球菌細(xì)菌測量單位：微米(μm)細(xì)菌大小與形態(tài)義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第12頁染色方法(一)簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一個(gè)染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌形態(tài)。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第13頁(二)復(fù)染色法

用兩種或各種染料染細(xì)菌，目標(biāo)是為了判別不一樣性質(zhì)細(xì)菌，所以又叫判別染色法。主要復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

革蘭氏染色法：不但能觀察到細(xì)菌形態(tài)，而且還可將全部細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G―表示。細(xì)菌對革蘭氏染色不一樣反應(yīng)，是因?yàn)樗鼈兗?xì)胞壁成份和結(jié)構(gòu)不一樣而造成。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第14頁試驗(yàn)材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蠟筆等。2.草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液、石炭酸復(fù)紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第15頁試驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌簡單染色步驟

涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取潔凈載玻片于試驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少許培養(yǎng)物與玻片上水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更加快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第16頁3．固定手持載玻片一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快往返經(jīng)過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時(shí)以載玻片后面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超出60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一個(gè))一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。

7．鏡檢義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第17頁(二)細(xì)菌革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20~30s，隨即水洗。5．用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)覺目標(biāo)物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞顏色。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第18頁革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第19頁步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈載玻片上

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第20頁義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第21頁步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第22頁步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第23頁步驟4：風(fēng)干

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第24頁步驟5：在酒精燈火焰外層盡快往返經(jīng)過3-4次固定義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第25頁步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第26頁步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第27頁步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第28頁步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，馬上用蒸餾水沖洗

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第29頁步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第30頁大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第31頁金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第32頁注意事項(xiàng)1．革蘭氏染色成敗關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過分，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。所以必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2．選取培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，因?yàn)榫w死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.潔凈玻片、熱固定、每一步水洗要徹底而且吸干等也是試驗(yàn)成功關(guān)鍵。義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第33頁義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第34頁鞭毛化學(xué)組成：鞭毛蛋白功效：運(yùn)動(dòng)器官與致病相關(guān)判定分類細(xì)菌義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講座第35頁莢膜化學(xué)組成：多糖或多肽功效：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)損傷作用義微生物基本操作規(guī)范制片染色和顯微觀察專家講